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transfizieren und Lipidomics durchführen.Wir stellen fest, dass die Plastizität von Lipidtröpfchen ein Schlüsselmerkmal der Infektion ist und dass die virale Ausbreitung durch niedermolekulare Inhibitoren der Glycerolipidbiosynthese blockiert werden kann.Wir stellen fest, dass diese Hemmung gegen die wichtigsten besorgniserregenden Varianten (Alpha, Beta, Gamma und Delta) wirksam war, was darauf hinweist, dass die Glycerolipid-Biosynthese ein konservierter Wirtsabhängigkeitsfaktor ist, der dieses sich entwickelnde Virus unterstützt.SARS-CoV-2 interagiert in jeder Phase seines Lebenszyklus mit Wirtsmembranen.Es durchquert direkt die Plasmamembran, um in die Zelle einzudringen, repliziert sich in vom Wirt stammenden Membrankompartimenten, erwirbt seine Hülle vom Wirt und wandert durch den Golgi und das Lysosom, um die Zelle zu verlassen.Alle Viren sind naturgemäß vollständig von Wirtswegen abhängig, um ihre metabolischen, strukturellen und Transportbedürfnisse zu erfüllen, und um wirksam zu sein, müssen sie diese Wirtswege auf irgendeine Weise modulieren.Ein dramatisches Beispiel dafür ist die Art und Weise, wie SARS-CoV-2 die inneren Membranen des Wirts in doppelmembranige Vesikel (DMVs) und Regionen mit gefalteter Membran (CM) umwandelt, um seine Replikation zu erleichtern1,2.Dieses allgemeine Muster von Membranumlagerungen ist bei (+)-strängigen RNA-Viren üblich3,4,5, obwohl die spezifischen Strukturen je nach Spezies variieren.Bei Flaviviren wie dem Zika-Virus6 und dem Dengue-Virus7 werden diese großflächigen Membranveränderungen von umfangreichen und vielfältigen Veränderungen auf molekularer Lipidebene begleitet.Es gibt viele vorläufige Hinweise darauf, dass die Manipulation von Wirtslipiden ein grundlegendes Merkmal der SARS-CoV-2-Infektion sein könnte.Mehrere Lipide und Lipid-assoziierte Proteine ​​wurden als Biomarker für Infektionen identifiziert, darunter VLDL- und HDL-Partikel8, Steroidhormone und verschiedene Apolipoproteine9, während sowohl erhöhtes Triacylglycerin (TAG)10 als auch mehrfach ungesättigte freie Fettsäuren11 als Marker für schwere Krankheitsverläufe in Betracht gezogen wurden.Darüber hinaus haben Patienten mit einem hohen BMI, Diabetes oder Bluthochdruck ein höheres Risiko, eine schwere Erkrankung zu entwickeln12.Diese Beobachtungen deuten auf systemische Veränderungen im Lipidstoffwechsel auf Organismusebene hin, aber es ist noch unbekannt, wie das Virus den Lipidstoffwechsel des Wirts auf zellulärer Ebene verändert und wie diese Veränderungen den viralen Lebenszyklus unterstützen.Hier zeigen wir, dass SARS-CoV-2s die Lipidbiosynthese des Wirts umprogrammiert und von spezifischen Stoffwechselwegen des Wirts abhängt, um effektiv zu überleben und sich zu replizieren.Um ein umfassendes Verständnis darüber zu erhalten, wie SARS-CoV-2 die zelluläre Lipidzusammensetzung umgestaltet, führen wir eine detaillierte Lipiduntersuchung sowohl an infizierten Zellen als auch an Zellen durch, die einzelne SARS-CoV-2-Proteine ​​ektopisch exprimieren, und zeigen massive Veränderungen in der Lipidzusammensetzung des Wirts als Ergebnis auf Infektion und als Folge der Aktivität spezifischer viraler Proteine, insbesondere unter den neutralen Lipiden.Basierend auf unseren anfänglichen Ergebnissen, die eine starke Induktion neutraler Lipide zeigen, untersuchen wir den Lipidtröpfchenfluss während der Infektion und beobachten eine dramatische Proliferation von Lipidtröpfchen und demonstrieren die Anforderungen an spezifische Wirtslipide unter Verwendung von niedermolekularen Inhibitoren der Glycerolipidbiosynthese in mehreren Stämmen von SARS- CoV-2.Wir haben in zwei Zelllinien nach 24 Stunden Infektion ein globales Lipidom-Profiling durchgeführt (Abb. 1A und ergänzende Abb. 1): HEK293T-Zellen, die das ACE2-Protein (HEK293T-ACE2) überexprimieren, um die Ergebnisse mit dem viralen Protein korrelieren zu können -transfizierte Zellen und die physiologisch relevanteren Zellen des Zelltyps A549-ACE2, um die bei einer natürlichen Infektion betroffenen Zellen zu modellieren.Jede Bedingung wurde biologisch fünffach wiederholt.Die gesamten zellulären Lipide wurden nach dem Verfahren von Bligh-Dyer13 extrahiert und durch Flüssigchromatographie-Elektrospray-Ionisations-Tandem-Massenspektrometrie (LC-ESI-MS/MS) analysiert.Die Häufigkeiten der identifizierten Lipide wurden durch Vergleich mit internen Standards für die quantitative Analyse normalisiert.In HEK293T-ACE2-Zellen haben wir 514 einzigartige Lipide identifiziert, die die Kategorien Glycerolipid, Phospholipid, Sphingolipid und Acylcarnitin umfassen (Ergänzungsdaten 1).Von diesen waren 409 (79,6 %) zwischen SARS-CoV-2 und einer Scheininfektion statistisch verändert (Benjamini-Hochberg adjustierter P < 0,05, Varianzanalyse [ANOVA]-Test) und veränderten sich als Reaktion auf die Infektion zwischen dem 2- und 64-fachen .In A549-ACE2-Zellen haben wir 443 einzigartige Lipide identifiziert, die dieselben Kategorien wie oben umfassen (Ergänzungsdaten 2).Von diesen waren 227 zwischen SARS-CoV-2 und Scheininfektion statistisch verändert (Benjamini-Hochberg adjustierter P < 0,05, Varianzanalyse [ANOVA]-Test) und veränderten sich als Reaktion auf die Infektion zwischen dem 1,1- und 19,7-fachen.Die Hauptkomponentenanalyse (PCA) dieser Beobachtungen bestätigte, dass der Infektionsstatus für die meisten Änderungen verantwortlich war (Abb. 1B und ergänzende Abb. 2), wobei die fünf infizierten Proben und die fünf Scheinproben in zwei unterschiedliche Gruppen fielen.Ein Lipidomics-Studiendesign.B Hauptkomponentenanalyse von 293T-ACE2-Zellen, die mit SARS-CoV-2 infiziert oder scheininfiziert sind (n = 5 biologische Replikate; jeder Punkt repräsentiert ein biologisches Replikat).C Individuelle Lipidspezies, gekennzeichnet durch Häufigkeit bei SARS-CoV-2-Infektion im Vergleich zu Mock in HEK293T-ACE2-Zellen (Datenpunkte sind Mittelwerte aus fünf biologischen Replikaten; jeder Datenpunkt repräsentiert eine Lipidspezies).Nur signifikant veränderte Lipide (P < 0,05, einfache ANOVA, mit Benjamini-Hochmini-Anpassung für Mehrfachvergleiche) werden gezeigt.Log2 (Fold Change) relativ zur Scheininfektion wird auf der x-Achse gezeigt.Einzelne Lipidspezies sind durch die Lipidklasse gefärbt, zu der sie gehören.DAG-Diacylglycerin;TAG Triacylglycerin;PC-Phosphatidylcholin;PE-Phosphatidylethanolamin;PG-Phosphatidylglycerin;PI Phosphatidylinositol;PS-Phosphatidylserin;CL-Cardiolipin;Cerceramid;HexCer-Hexosylceramid;SM-Sphingomyelin;Carn-Acylcarnitin;CE-Cholesterinester.D Individuelle Lipidspezies, gekennzeichnet durch Häufigkeit bei SARS-CoV-2-Infektion im Vergleich zu Mock in A549-ACE2-Zellen (Datenpunkte sind Mittelwerte aus 5 biologischen Wiederholungen; jeder Datenpunkt repräsentiert eine Lipidspezies).Nur signifikant geändert (P < 0,05, einfache ANOVA, mit Benjamini-Hochmini-Anpassung für multiple Vergleiche).Es gelten dieselben Farben und Abkürzungen wie in (C).Quelldaten werden in Supplementary Data 1 (HEK293T-ACE2-Zellen) und Supplementary Data 2 (A549-ACE2-Zellen) bereitgestellt.Wir untersuchten dann, wie sich diese Veränderungen in der Lipidzusammensetzung des Wirts basierend auf Klasse und Acylkette auflösten.In beiden Zelllinien nehmen die TAG-Spezies dramatisch zu, ebenso wie die Ceramide (Abb. 1C, D).Bei der genaueren Untersuchung der Natur der einzelnen Lipidspezies, die sich verändert hat (Abb. 1C), haben wir beobachtet, dass sich die TAG-Spezies basierend auf ihrer Fettsäurezusammensetzung ändern.TAG-Spezies, die Ketten mehrfach ungesättigter Fettsäuren (PUFA) tragen, waren in 293T-ACE2-Zellen durchschnittlich 8-mal stärker erhöht als gesättigte oder einfach ungesättigte Spezies und in A549-ACE2-Zellen durchschnittlich 2-mal stärker als gesättigte oder einfach ungesättigte Spezies.Dieser Trend wurde auch bei Phospholipiden beobachtet: Gesättigte Phospholipide (Phosphatidylcholin, PC; Phosphatidylethanolamin, PE; Phosphatidylglycerol, PG; Phosphatidylinositol PI) nahmen fast überall ab, während viele mehrfach ungesättigte Spezies zunahmen, insbesondere P-PC (Phosphatidylcholin, plasmalogengebunden) (2,7- fach, HEK293T-ACE2; 1,5-fach, A549-ACE2), PC (1,5-fach, HEK293T-ACE2; 1,4-fach, A549-ACE2) und PG (1,7-fach, HEK293T-ACE2, 1,3-fach, A549- ACE2).Es gibt einige Unterschiede im Lipid-Remodeling zwischen den beiden Zelllinien;insbesondere die Wirkung auf PI-Arten, wobei der PI in HEK293T-ACE2-Zellen im Allgemeinen abnimmt und in A549-ACE2-Zellen zunimmt.Cardiolipin nimmt in HEK293T-ACE2-Zellen ab, ändert sich aber nicht in A549-ACE2-Zellen;Cholesterinester steigen in A549-ACE2-Zellen, aber nicht in HEK293T-ACE2-Zellen.Während einige Unterschiede im Lipidstoffwechsel zwischen Zelllinien nicht unerwartet sind, deuten die auffälligen Ähnlichkeiten bei vielen Lipidarten darauf hin, dass SARS-CoV-2 Lipidanforderungen definiert hat, die es in verschiedenen Zelltypen, die es infiziert, entwickelt.Das Genom von SARS-CoV-2 codiert 29 einzelne Proteine ​​(Abb. 2A).Einige dieser Proteine ​​wurden direkt in SARS-CoV-2 untersucht, aber die Rolle der meisten von ihnen muss im Vergleich zu den Proteinen von SARS-CoV extrapoliert werden, die besser untersucht sind (Abb. 2B).Mehrere SARS-CoV-Proteine ​​manipulieren direkt Zellmembranen – nsp3, nsp4 und nsp6 zusammen sind dafür bekannt, DMVs14 und CMs15,16 zu induzieren, die für eine Coronavirus-Infektion charakteristisch sind17,18, und orf619 hat auch einen dramatischen Membranumbau-Phänotyp.Einige Proteine ​​von SARS-CoV-2 – nsp1, nsp8, nsp9, nsp16 – haben direkte Auswirkungen auf das mRNA-Spleißen oder die Proteinexpression und Membranintegration20.Viele Proteine ​​beider Viren enthalten Transmembrandomänen (nsp221, orf7a22, orf7b23, orf3a24,25) oder Lipidbindungstaschen (orf9b26) unbekannter Funktion, und viele andere, einschließlich nsp327, nsp628, orf3a29,30, orf631 und orf7a32 – vermitteln Zellen Stresswege wie Apoptose, Autophagie und die unfolded protein response (UPR), von denen bekannt ist, dass sie die zelluläre Lipidzusammensetzung verändern33,34,35 (Abb. 2B).A Offene Leserahmen des SARS-CoV-2-Genoms.B Vermutliche Funktionen von SARS-CoV-2-Proteinen, basierend auf frühen Studien und Sequenzähnlichkeit zu Proteinen von SARS-CoV.C Lipidomics-Studiendesign.D–F Individuelle Lipidspezies, charakterisiert durch Klasse und Familie (Datenpunkte sind Mittelwerte aus fünf biologischen Wiederholungen; jeder Datenpunkt repräsentiert eine Lipidspezies).Nur signifikant veränderte Lipide (P < 0,05, einfache ANOVA, Benjamini-Hochmini-adjustiert für multiplen Vergleich) werden gezeigt.Log2(Fold Change) relativ zum leeren Vektor wird auf der x-Achse angezeigt.Einzelne Lipidspezies sind durch die Lipidklasse gefärbt, zu der sie gehören.Abkürzungen wie in Abb. 1. Quelldaten sind in Supplementary Data 3 angegeben.Um zu beurteilen, wie sich jedes SARS-CoV-2-Protein auf den Lipidstoffwechsel des Wirts auswirkt, führten wir ein ungezieltes Lipidom-Profiling von Zellen durch, die mit jedem viralen Protein transfiziert waren, das im PLVX-Vektor mit einem C-terminalen Strep-Tag exprimiert wurde.Wir haben die Expression jedes Proteins in HEK-293T-Zellen optimiert und die Transfektionseffizienz durch Immunfluoreszenz des Strep-Tags gemessen (ergänzende Abb. 2).Um aussagekräftige Vergleiche zwischen diesen Bedingungen anzustellen, war eine hohe Transfektionseffizienz erforderlich (> 70 %).Trotz unserer Bemühungen wurde dieses Effizienzniveau für fünf Proteine ​​(nsp3, nsp14, nsp15, nsp16, orf3b) nicht erreicht;daher fuhren wir mit den verbleibenden 24 fort. Jedes virale Protein sowie der leere PLVX-Vektor wurden verwendet, um 6-cm-Schalen mit HEK293T-Zellen in biologischer Fünffachausfertigung zu transfizieren.Nach 48 h Transfektion wurden die gesamten zellulären Lipide nach dem Verfahren von Bligh-Dyer13 extrahiert und durch Flüssigchromatographie-Elektrospray-Ionisations-Tandem-Massenspektrometrie (LC-ESI-MS/MS) analysiert (Abb. 2C).Die Häufigkeiten der identifizierten Lipide wurden durch Vergleich mit internen Standards für die quantitative Analyse normalisiert.Insgesamt identifizierten wir 396 einzigartige Lipide aus den Kategorien Glycerolipid, Phospholipid, Sphingolipid und Acylcarnitin (Ergänzungsdaten 3).Davon waren 317 (80 %) bei mindestens einer Transfektion signifikant verändert (Benjamini-Hochberg adjustierter P < 0,05, ANOVA).Für die mit viralen Proteinen transfizierten Proben führten wir einen EASE (Expression Analysis Systematic Explorer) Score-Anreicherungstest von statistisch signifikanten Lipiden mit Lipid Mini-On durch.Lipid Mini-On führt Anreicherungsanalysen von Lipidomikdaten mithilfe eines Text-Mining-Prozesses durch, der einzelne Lipidnamen basierend auf ihrer Klassifizierung und anderen Merkmalen wie Kettenlänge und Anzahl der Doppelbindungen in mehrere Lipid-Ontologiegruppen einteilt.Unter Verwendung von Lipid Mini-On stellten wir fest, dass die häufigsten Anreicherungen, die mit den viralen Proteintransfektionen erhöht wurden, insbesondere PIs (erhöht in 21 von 28 Transfektionen), Diacylglycerole (DAGs) (12 Transfektionen) und ethergebundene Lipide waren Vinyletherphosphatidylcholine (O-PC) (10-12 Transfektionen), Cer (10 Transfektionen) und TAG (6 Transfektionen).Anreicherungen, bei denen eine Verringerung festgestellt wurde, waren Lyso-PC (verringert bei 21 Transfektionen), CLs (12 Transfektionen), deren Häufigkeit fast überall abnimmt, und TAGs (verringert bei 14 Transfektionen) (zusammengefasst in Abb. 2, D–F; Faltungsänderungen für alle signifikanten Lipide sind in der ergänzenden Abb. 3) dargestellt.Die 24 untersuchten viralen Proteine ​​zeigen eine Vielzahl von Lipidveränderungen, was darauf hindeutet, dass SARS-CoV-2 den Lipidstoffwechsel des Wirts auf vielfältige Weise durch mehrere molekulare Mechanismen beeinflusst.Anhand von drei umfangreichen Datensätzen virusinduzierter Lipidveränderungen versuchten wir, die bei lebenden Virusinfektionen beobachteten Veränderungen mit der Wirkung spezifischer viraler Proteine ​​in Verbindung zu bringen.Zunächst führten wir eine unbeaufsichtigte Clusterbildung der normalisierten Lipidspezies durch, die im proteintransfizierten Datensatz von t-SNE beobachtet wurden (Abb. 3A).Während sich die meisten Phospholipide nicht wesentlich anhäuften, bildete insbesondere TAG deutliche Anhäufungen, und in Anlehnung an den Phänotyp des lebenden Virus häuften sich gesättigte Spezies und mehrfach ungesättigte Spezies separat an.Bemerkenswerterweise wurden zwei weitere molekulare Merkmale der Infektion – Cer und CL – ebenfalls in unterschiedliche Cluster eingeteilt.A Unüberwachte Clusterbildung der normalisierten Lipidspezies, die in dem Protein-transfizierten Datensatz durch t-SNE beobachtet wurde.Abkürzungen wie in Abb. 1. B Zusammenfassung der nach Infektion mit SARS-CoV-2 veränderten Lipide sowohl in HEK293T-ACE2-Zellen als auch in A549-ACE2-Zellen.Cer = Ceramid;PL (PUFA) = Phospholipide, die mehrfach ungesättigte Acylketten tragen;TAG = Triacylglycerin;PL (Sat) = Phospholipide, die gesättigte oder einfach ungesättigte Acylketten tragen.C Durchschnittliche Veränderung innerhalb jeder oben beschriebenen Klasse in jeder Bedingung, sowohl Lebendvirusinfektion (HEK293T-ACE2-Zellen) als auch ektopische Proteinexpression.Bei dieser Berechnung wurden nur signifikant veränderte (P < 0,05, siehe Fig. 1 und 2 für Beschreibungen statistischer Tests im lebenden Virus bzw. Transfektionsbedingungen) Lipidspezies verwendet.Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.Wir verglichen die beiden lebenden Virusinfektionsdatensätze, um Lipidphänotypen auszuwählen, die häufige Ergebnisse einer Infektion zwischen den beiden Zelllinien waren.Dies sind signifikante Veränderungen in TAG, Cer und Phospholipiden, die mehrfach ungesättigte Fettacylketten tragen, mit einer Abnahme von DAG und gesättigten Phospholipiden (Fig. 3B).Um jedes virale Protein auf seine Fähigkeit, diese Veränderungen hervorzurufen, zu beurteilen, wurde die durchschnittliche Veränderung für jede dieser Klassen für jede Bedingung berechnet (Abb. 3C).Wieder einmal haben wir gesehen, dass das Virus über mehrere Proteine ​​verfügt, die die Umgestaltung der Lipidumgebung seiner Wirtszellen beeinflussen, was auf eine unterschiedliche Rolle für jedes virale Protein hindeutet.Jedes Merkmal der Infektion wurde durch mindestens ein Protein rekapituliert, und verschiedene Proteine ​​scheinen für verschiedene Aspekte des Lipid-Phänotyps des lebenden Virus verantwortlich zu sein.Insbesondere wurde die TAG-Erhöhung durch fünf Proteine ​​(orf6, nsp13, nsp5, orf9c, nsp1) rekapituliert.Der Cer-Anstieg wurde ebenfalls von sechs (nsp6, orf6, nsp5, orf9c, orf3a und orf7a) rekapituliert, und der Anstieg von mehrfach ungesättigtem PC (sowohl ether- als auch estergebunden) wurde von vier (orf6, orf9c, orf9b und E) rekapituliert. .Bemerkenswerterweise rekapitulierten orf6 und orf9c alle drei dieser charakteristischen Veränderungen und rekapitulierten auch die individuellsten Phänotypen aller Proteine.TAG ist das am stärksten und am wesentlichsten erhöhte Lipid als Reaktion auf eine virale Infektion.TAG wird durch die Acylierung von DAG durch DGAT1 oder DGAT2 produziert, wo es dann in Lipidtröpfchen sequestriert wird, die als Quelle für Fettsäuren zugänglich sind.Der TAG-Abbau ist das Ergebnis mehrerer Lipasen, die eine Acylkette entfernen, um DAG zu produzieren (Fig. 4A).Lipidtröpfchen (LDs) sind das zelluläre Reservoir für TAGs und spielen eine etablierte Rolle im Lebenszyklus anderer Viren.Sowohl das Hepatitis-C-Virus (HCV) als auch Rotaviren bewirken, dass sich LDs während der Infektion ansammeln, und HCV verwendet LDs als Ort der viralen Assemblierung, während die Rotavirus-Replikation in unmittelbarer Nähe zu Lipidtröpfchen erfolgt36,37.Das Dengue-Virus hingegen verbraucht Lipidtröpfchen des Wirts und scheint sie als Quelle für die Beta-Oxidation zu verwenden38.Ein Überblick über den zentralen Glycerolipidstoffwechsel.PA = Phosphatidsäure;PAP = Phosphatidsäurephosphatase;LPP = Lysophosphatidsäurephosphatase;DGK: Diacylglycerinkinase;DAG = Diacylglycerin;TAG = Triacylglycerin;DGAT 1/2 = Diacylglycerolacetyltransferase 1/2;PLC = Phospholipase C. B 293T-ACE2- und Caco-2-Zellen, die mit dem SARS-CoV-2-Stamm USA-WA1/2020 (MOI = 1) infiziert und zu den angegebenen Zeitpunkten fixiert wurden.LDs und infizierte Zellen wurden mit BODIPY 493/503 bzw. Anti-dsRNA-Immunfluoreszenz sichtbar gemacht.Bilder sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente.C, F Anzahl der Lipidtröpfchen pro Zelle;Jeder Datenpunkt ist eine Zelle.P-Werte werden von der einfachen ANOVA relativ zur 8-hpi-Bedingung abgeleitet.D, G Verteilungsdiagramm der Fläche jedes einzelnen Lipidtröpfchens aus (C, F) in Pixeln.P-Werte werden von der einfachen ANOVA relativ zur 8-hpi-Bedingung abgeleitet.E, H Kolokalisierung von dsRNA und BODIPY durch den Pearson-Koeffizienten.Jeder Datenpunkt ist eine Zelle.P-Werte werden von der einfachen ANOVA relativ zur 8-hpi-Bedingung abgeleitet.I 293T-Zellen, transfiziert mit den angegebenen viralen Proteinen, 48 h nach der Transfektion.Bilder sind repräsentativ für zwei unabhängige Experimente.J Verteilungsdiagramm der Anzahl von Lipidtröpfchen pro Zelle bei jeder Transfektion.P-Werte werden von der einfachen ANOVA relativ zur Bedingung „Leerer Vektor“ abgeleitet.Die Boxplots werden mit den Elementen dargestellt: Mittellinie, Median;Boxgrenzen, Q1 und Q3;Schnurrhaare, 1,5 x Quartilabstand.Auch Ausreißer werden angezeigt.Quelldaten für alle Panels werden als Quelldatendatei bereitgestellt;n Zahlen (die Zellen darstellen) für jede Bedingung können in der Quelldatendatei gefunden werden.Wir wollten verstehen, wie sich die Häufigkeit und Morphologie von Lipidtröpfchen des Wirts im Verlauf einer SARS-CoV-2-Infektion ändert und ob sie mit virusinduzierten Membranstrukturen assoziiert sind.Wir wählten BODIPY 493/503, einen hellen, hydrophoben Farbstoff, um die Lipidtröpfchen zu markieren, eine bewährte Methode39.Wir haben auch einen Anti-dsRNA-Antikörper verwendet, um die Stellen der viralen Replikation zu markieren;dsRNA ist ein Zwischenprodukt bei der Synthese des RNA-Genoms des Virus und es wurde gezeigt, dass es sich an DMVs14 anlagert.Wir haben diese beiden Marker 8 h, 24 h oder 48 h nach der Infektion in HEK-293T-Zellen sichtbar gemacht und dann mit BODIPY 493/503 gefärbt, um Lipidtröpfchen und einen Anti-dsRNA-Antikörper zu markieren, um die Stelle der viralen Replikation zu markieren (Abb 4B).Wir sehen einen deutlichen Anstieg der Anzahl und Größe von Lipidtröpfchen in zeitabhängiger Weise im Verlauf der Infektion, quantifiziert in Abb. 4C, D. Lipidtröpfchen pro Zelle steigen von null bei 8hpi auf durchschnittlich 6,7 bei 24 hpi auf durchschnittlich 21,5 bei 48 hpi.Die Lipidtröpfchenfläche steigt von null Pixel pro Tröpfchen bei 8 hpi auf durchschnittlich 177 Pixel pro Tröpfchen bei 24 hpi auf durchschnittlich 400 Pixel pro Tröpfchen bei 48 hpi.Es scheint jedoch keine Kolokalisierung der Lipidtröpfchen und der dsRNA zu geben, was darauf hindeutet, dass das Virus Lipidtröpfchen nicht direkt als Plattform für die Replikation verwendet (Abb. 4E).Um diese Beobachtungen weiter zu validieren, wurden ähnliche Experimente in der humanen epithelialen Caco2-Zelllinie durchgeführt.Hier wurde ein leichter Anstieg der Lipidtröpfchenzahl beobachtet, von durchschnittlich 8 Lipidtröpfchen pro Zelle bei 8 und 24 hpi auf durchschnittlich 15,9 Lipidtröpfchen pro Zelle bei 48 hpi, obwohl der Anstieg nicht signifikant war.Die Fläche der Lipidtröpfchen nahm jedoch im Verlauf der Infektion in ähnlichem Maße wie in HEK293T-ACE2-Zellen von durchschnittlich 136,5 Pixeln pro Tröpfchen bei 8 hpi auf durchschnittlich 192,5 Pixel pro Tröpfchen bei 24 hpi bis zu einem Durchschnitt signifikant zu von 431,1 Pixel pro Tröpfchen bei 48 hpi (Abb. 4F, G).Auch hier wurde keine Kolokalisation mit dsRNA beobachtet (Abb. 4H).Da unsere Lipidomik-Experimente darauf hindeuteten, dass fünf einzelne SARS-CoV-2-Proteine ​​unabhängig voneinander die Produktion von TAG induzieren konnten (nsp1, nsp5, nsp13, orf6 und orf9c), fragten wir uns, ob diese Proteine ​​auch in der Lage sind, die Lipidbildung zu verändern Tröpfchen.Wir transfizierten HEK293T-Zellen mit jedem dieser Plasmide sowie einer leeren Vektorkontrolle und färbten sie mit BODIPY493/503, um Lipidtröpfchen sichtbar zu machen, und einem Anti-Strep-Antikörper, um transfizierte Zellen zu identifizieren (Abb. 4I, quantifiziert in Abb. 4J). .Wir beobachteten eine starke und signifikante Induktion von Lipidtröpfchen für vier der fünf Proteine ​​im Vergleich zum leeren Vektor (nsp1, nsp5, orf6 und orf9c), was darauf hindeutet, dass diese Proteine ​​eine direkte Rolle bei der Stimulierung der TAG-Synthese spielen, die natürlicherweise die Bildung verursachen würde von Lipidtröpfchen.Da die Konzentrationen einzelner Glycerolipid-Spezies sowie Glycerolipid-basierter Strukturen durch die Infektion verändert wurden, fragten wir uns, ob diese Wege für die virale Proliferation notwendig sind.Wir haben eine Reihe im Handel erhältlicher niedermolekularer Inhibitoren der Lipidsynthese ausgewählt, wobei wir uns auf Inhibitoren der De-novo-Synthese neutraler Lipide sowie auf lipolytische Enzyme des Lipidrecyclings konzentrierten (Abb. 5A–F).Wir führten anfängliche Zytotoxizitätsmessungen mit einem auf Resazurin basierenden Lebensfähigkeitsassay durch40 (ergänzende Abb. 4) und wählten eine nicht-zytotoxische Konzentration jeder Verbindung aus, um sie auf Hemmung einer Virusinfektion zu untersuchen.HEK293T-ACE2-Zellen wurden über Nacht mit jeder Verbindung behandelt und dann mit SARS-CoV-2 infiziert.Nach 48 h Infektion wurden Kulturüberstände gesammelt und die Menge an infektiösem Virus, die in Gegenwart jeder Verbindung produziert wurde, wurde durch Fokusbildungsassay quantifiziert41.A–F Screen von neutralen Lipidbiosyntheseinhibitoren.HEK-293T-ACE2-Zellen wurden vor der Infektion über Nacht mit 10 &mgr;M jeder Verbindung behandelt.Die Zellen wurden 48 h vor dem Sammeln des Überstands infiziert.Balken stellen virale Titer von Zellen dar, die mit den angezeigten Inhibitoren behandelt wurden, gemessen durch einen fokusbildenden Assay.Die Boxplots werden mit den Elementen dargestellt: Mittellinie, Median;Boxgrenzen, Q1 und Q3;Whiskers, 1,5 x Quartilsabstand, aus drei unabhängigen Experimenten;Es werden auch einzelne Datenpunkte gezeigt, die biologische Replikate darstellen (n = 9).P-Werte sind abgeleitete einfache ANOVA.FASN = Fettsäuresynthase;PAP = Phosphatidsäurephosphatase;LPP = Lipidphosphatphosphatase;DGK = Diacylglycerinkinase;ATGL = Fett-Triacylglycerol-Lipase;DGAT = Diacylglycerolacetyltransferase;PLC = Phospholipase CG EC50-Kurven für ausgewählte Inhibitoren in 293T-ACE2-Zellen.HEK-293T-ACE2-Zellen wurden vor der Infektion über Nacht mit zweifachen Verdünnungen jeder Verbindung behandelt.Die Zellen wurden 48 h vor dem Sammeln des Überstands und dem fokusbildenden Assay infiziert.Die prozentuale Infektion wird berechnet als [Titer(Inhibitor)/Titer(Vehikel)]*100.Die Daten stammen aus drei unabhängigen Experimenten.Fehlerband ist SE;das Maß der Mitte für das Fehlerband ist der Mittelwert.Kurvenanpassungen werden unter Verwendung einer nichtlinearen Kurvenanpassung an die Hill-Gleichung berechnet: Reaktion = (Max. Reaktion)/(1 + [EC50/Konzentration]^n), wobei die maximale Reaktion als 100 % Hemmung definiert ist.H EC50-Kurven für ausgewählte Inhibitoren in Caco2-Zellen.Experiment und Analyse wie in (G) beschrieben.I EC50-Werte aus den Kurven in G und H. EC50-Werte werden aus der oben beschriebenen Kurvenanpassung berechnet.Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.Dieser Screen enthüllte mehrere Schritte der Lipidbiosynthese, die für die Produktion infektiöser Virionen wesentlich sind.Die De-novo-Fettsäuresynthese erschien kritisch, da GSK2194069, ein Inhibitor der Fettsäuresynthase (FASN)42, sowie Orlistat, ein unspezifischer Lipaseinhibitor und Inhibitor der Fettsäuresynthetase FASN43,44, ein von der FDA zugelassenes Medikament, beide vollständig blockierte Virusproduktion (Fig. 5C, D).TAG-Synthese und Lipolyse sind beide erforderlich, da PF-04620110, ein Inhibitor von DGAT145, Orlistat und CAY10499, ein unspezifischer Lipase-Inhibitor46,47, alle die Infektion blockierten (Abb. 5E, D, B).Atglistatin48, das spezifisch die Fett-Triacylglycerol-Lipase blockiert, hemmte teilweise die Virusproduktion ( 5A ), was darauf hindeutet, dass die Hemmung der Breitspektrum-Lipase wirksamer ist als die Hemmung nur einer Lipase.Die Bedeutung der DAG-Produktion für das Virus, vielleicht als Vorläufer von TAG, wird durch die Wirksamkeit von U-73122 (Fig. 5F) angezeigt, das Phospholipase-C-abhängige Prozesse hemmt49.Um die Inhibitoren des zentralen Glycerolipidstoffwechsels direkt zu vergleichen, entwarfen wir eine detailliertere Studie, um eine Reihe von Konzentrationen für jeden Inhibitor zu testen.Wir haben eine Reihe von zweifachen Verdünnungen jeder Verbindung getestet und parallel zum fokusbildenden Assay zur Bewertung der Virusreplikation einen Resazurin-basierten Zytotoxizitätsassay durchgeführt, um zu bestätigen, dass ein Mangel an Virusproduktion nicht auf eine beeinträchtigte Zelllebensfähigkeit zurückzuführen ist (Ergänzende Abb. 4).Der etwa fünfzigfach wirksamste Inhibitor war GSK2194069 (EC50 = 1,8 nM, HEK293T-ACE2).GSK2194069 blockiert FASN, was darauf hindeutet, dass die De-novo-Lipidsynthese für das Überleben des Virus unbedingt erforderlich ist.Orlistat folgte in der Wirksamkeit (EC50 = 94 nM, HEK293T-ACE2) und betonte die Bedeutung sowohl der Fettsäuresynthese als auch der Lipolyse für das Virus.Der andere Breitband-Lipase-Inhibitor, CAY10499 (EC50 = 157 nM, 283T-ACE2) hatte eine ähnliche Wirksamkeit wie PF04620110 (EC50 = 490 nM, 293T-ACE2).Atglistatin, der spezifischste Lipaseinhibitor, wurde zytotoxisch, bevor eine vollständige Hemmung erreicht wurde, und daher konnte kein EC50 berechnet werden;sicherlich ist er höher als 10 µM, was wiederum zeigt, dass das Virus nicht von der Aktivität einer bestimmten Lipase abhängig ist, sondern eher von einer bestimmten Lipidzusammensetzung.Zusammengenommen weisen diese Ergebnisse auf eine starke Abhängigkeit vom Fettstoffwechsel des Wirts und insbesondere vom Glycerolipidfluss hin.Die De-novo-Synthese von TAG ist ebenso erforderlich wie die Fähigkeit, die in diesem neutralen Speicherlipid eingeschlossenen Fettsäuren durch Lipolyse freizusetzen.Da unsere wirksamsten Inhibitoren alle in irgendeiner Weise mit der Dynamik der TAG-Produktion zusammenhängen, stellten wir die Hypothese auf, dass ihre Wirksamkeit auf den spezifischen Anforderungen des Virus an Lipidtröpfchen beruht.Wir führten eine Mikroskopie von Zellen durch, die mit ausgewählten Inhibitoren bei 10 μM über Nacht behandelt wurden (Abb. 6A, quantifiziert in Abb. 6B, experimentelles Schema in ergänzender Abb. 5).Wir beobachteten erneut, dass das Virus allein eine signifikante Erhöhung der Anzahl der Lipidtröpfchen pro Zelle von durchschnittlich 0,3 auf durchschnittlich 3 induzierte, und stellten ferner fest, dass in Abwesenheit des Virus keiner der Inhibitoren eine Wirkung auf die Lipidtröpfchen hatte Zahlen.In Gegenwart von Viren verhinderte die Behandlung mit GSK2194069 im Gegensatz zu PF04620110 keinen statistisch signifikanten Anstieg der Zahl der Lipidtröpfchen, was darauf hindeutet, dass DGAT1 für die virusinduzierte Produktion von Lipidtröpfchen unerlässlich ist.Orlistat führte unterdessen zu einem Anstieg der Zahl der Lipidtröpfchen im Vergleich zur Vehikelbehandlung während der Infektion von durchschnittlich 3 auf durchschnittlich 7,5.Diese Ergebnisse unterstreichen die Spezifität des Bedarfs von SARS-CoV-2 an Lipidtröpfchen: Während eine SARS-CoV-2-Infektion zu einem allgemeinen Anstieg der Lipidtröpfchen in jeder infizierten Zelle führt, sind sowohl die TAG-Synthese als auch die Lipolyse erforderlich, um die Produktion von Infektionskrankheiten zu unterstützen Virionen.Darüber hinaus unterstützt die bloße Erhöhung der Anzahl an Lipidtröpfchen die Replikation nicht: Die reine Akkumulation von TAG, die aus der Hemmung der Lipolyse resultiert, ist ebenso schädlich für die Infektion wie die Verhinderung ihrer Synthese.A Repräsentative Bilder von HEK293T-ACE2-Zellen, die mit jedem angegebenen Inhibitor (10 µM) oder Vehikel (DMSO) behandelt, 48 h mit SARS-CoV-2 infiziert (MOI = 1) und gefärbt wurden, um Lipidtröpfchen sichtbar zu machen (BODIPY 493/503 ) und dsRNA.Bilder sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente.B Quantifizierung der Lipidtröpfchenzahlen in (A).Die Daten sind Mittelwerte ± SE für n = 6 biologische Wiederholungen;P-Werte werden aus der einfachen ANOVA abgeleitet.C Teilweise Wiederherstellung der Hemmung der viralen Replikation durch Supplementierung mit exogenen Fettsäuren.Inhibitoren und Fettsäuren werden beide mit 10 &mgr;M verwendet, die gleichzeitig über Nacht vor einer 48-stündigen Infektion verabreicht werden (MOI = 0,1).Die Daten sind Mittelwerte ± SE für n = 10 biologische Wiederholungen aus drei unabhängigen Experimenten.D GFP-Fluoreszenz, die aus einer Infektion mit Lentivirus resultiert, das entweder mit dem SARS-CoV-2-Spike-Protein oder dem VSV-G-Protein pseudotypisiert ist.Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung für n = 5 biologische Wiederholungen.E Hemmung des ursprünglichen Stamms und vier bedenklicher Varianten von SARS-CoV-2 in 293T-ACE2-Zellen durch vier Inhibitoren der Glycerolipid-Biosynthese, jeweils bei 10 µM über Nacht vor einer 48-stündigen Infektion (MOI = 0,1).Die Daten stammen aus drei unabhängigen Experimenten;Daten sind Mittelwerte ± SE für n = 6 biologische Wiederholungen.FA-Modell für neutralen Lipidfluss während einer SARS-CoV-2-Infektion.vRNA virale RNA;PM-Plasmamembran;DGAT1 Diacylglycerolacetyltransferase 1;TAG Triacylglycerin;DAG-Diacylglycerin;ER endoplasmatisches Retikulum;CM gefaltete Membran;DMV-Doppelmembran-Vesikel-Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.SARS-CoV-2 interagiert in jeder Phase seines Lebenszyklus mit Lipiden des Wirts.Um die Möglichkeit auszuschließen, dass der Glycerolipidstoffwechsel für die anfängliche Anheftung und Endozytose des Virus erforderlich ist, führten wir einen Entry-Assay unter Verwendung von Spike-pseudotypisiertem Lentivirus durch.Für dieses Experiment wurden Lentiviren generiert, die das SARS-CoV-2-Spike-Protein aufweisen und einen GFP-Reporter tragen;Lentiviren, die stattdessen mit dem VSV-G-Protein beschichtet waren, wurden als Kontrolle verwendet.Erfolgreich infizierte Zellen exprimieren GFP, und quantitative Mikroskopie wurde verwendet, um die Infektion zu beurteilen (ergänzende Abb. 5B).HEK293T-ACE2-Zellen wurden über Nacht mit ausgewählten Inhibitoren der Glycerolipid-Biosynthese behandelt und dann mit einem dieser beiden Lentivirus-Konstrukte infiziert.Wir beobachteten keine signifikante Verringerung des Viruseintritts in Gegenwart eines der getesteten Inhibitoren, was darauf hindeutet, dass das Virus von diesem Lipidbiosyntheseweg abhängt, um die intrazellulären Stadien seines Lebenszyklus zu erleichtern ( 6D ).Da wir feststellen, dass Lipolyse, TAG-Synthese und De-novo-Fettsäuresynthese für die virale Replikation entscheidend sind, fragten wir weiter, ob die Hemmung eines dieser Enzyme durch die Zugabe von exogenen Fettsäuren überwunden werden könnte.Wir behandelten HEK293T-ACE2-Zellen gleichzeitig mit jedem Inhibitor wie oben und gleichzeitig mit BSA, das mit 10 &mgr;M Palmitinsäure, Ölsäure, Arachidonsäure oder fettsäurefreiem BSA-Träger allein vorkomplexiert war.Nach dieser Behandlung über Nacht haben wir uns mit SARS-CoV-2 infiziert und nach 48 h Überstände geerntet, um das freigesetzte Virus zu messen.Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.ADS CAS PubMed PubMed Central-Artikel Google ScholarNat.Kommun.ADS CAS PubMed PubMed Central-Artikel Google ScholarNat.Kommun.ADS CAS PubMed PubMed Central-Artikel Google ScholarWissenschaft.CAS PubMed-Artikel Google ScholarWissenschaft.ADS CAS PubMed PubMed Central-Artikel Google ScholarWissenschaft.ADS CAS PubMed PubMed Central-Artikel Google ScholarJ. 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