Cardiovascular Diabetology Band 21, Artikelnummer: 106 (2022 ) Diesen Artikel zitierenEs wurde berichtet, dass Empagliflozin die Endothelzellfunktion unabhängig vom Diabetesstatus schützt.Die Rolle von Empagliflozin beim mikrovaskulären Schutz während einer myokardialen Ischämie-Reperfusionsverletzung (I/R) wurde jedoch noch nicht vollständig verstanden.Elektronenmikroskopie, Western Blots, Immunfluoreszenz, qPCR, Mutantenplasmid-Transfektion und Co-Immunpräzipitation wurden eingesetzt, um zu untersuchen, ob Empagliflozin mikrovaskuläre Schäden und Endothelschäden während einer Herz-I/R-Verletzung lindern könnte.Bei Mäusen schwächte Empagliflozin die durch I/R-Verletzungen induzierte mikrovaskuläre Okklusion und Mikrothrombusbildung ab.In humanen Endothelzellen der Koronararterie führte eine I/R-Verletzung zu einer Hochregulierung des Adhäsionsfaktors, einer Inaktivierung der endothelialen Stickoxidsynthase, einer Herabregulierung der fokalen Adhäsionskinase, einer Barrierendysfunktion, einem Abbau des Zytoskeletts und einer zellulären Apoptose;Die Behandlung mit Empagliflozin verringerte diese Wirkungen jedoch.Empagliflozin verbesserte den mitochondrialen oxidativen Stress, die mitochondriale Atmung und den Adenosintriphosphat-Metabolismus in I/R-behandelten Endothelzellen der menschlichen Koronararterie, indem es die Phosphorylierung des Dynamin-related Protein 1 (Drp1) und des mitochondrialen Spaltungsproteins 1 (Fis1) verhinderte und so die mitochondriale Spaltung unterdrückte.Die Schutzwirkung von Empagliflozin auf die mitochondriale Homöostase und Endothelfunktion wurde durch die Wiedereinführung von phosphoryliertem Fis1, aber nicht von phosphoryliertem Drp1 aufgehoben, was darauf hindeutet, dass die Fis1-Dephosphorylierung der vorherrschende Mechanismus ist, durch den Empagliflozin die mitochondriale Spaltung während einer I/R-Verletzung hemmt.Außerdem induzierte die I/R-Verletzung die Fis1-Phosphorylierung hauptsächlich durch Aktivierung des Signalwegs der katalytischen DNA-abhängigen Proteinkinase-Untereinheit (DNA-PKcs), während Empagliflozin diesen Signalweg durch antioxidative Wirkungen inaktivierte.Diese Ergebnisse zeigten, dass Empagliflozin die Mikrovaskulatur schützen kann, indem es den DNA-PKcs/Fis1/mitochondrialen Spaltungsweg während einer myokardialen I/R-Verletzung hemmt.Die Revaskularisation verschlossener Koronararterien ist ein therapeutischer Standardansatz für Patienten mit Myokardinfarkt.Die Revaskularisierung induziert jedoch auch eine Ischämie/Reperfusion (I/R)-Schädigung in Herzgeweben, einschließlich Kardiomyozyten und Endothelzellen [1, 2].I/R-Verletzungs-induzierte endotheliale Dysfunktion ist mit mikrovaskulärer Verletzung verbunden, die durch Perfusionsdefekte, mikrovaskuläre Spasmen, Mikrothrombusbildung und erhöhte Gefäßpermeabilität gekennzeichnet ist [3,4,5].Eine kardiale mikrovaskuläre I/R-Verletzung erweitert die Infarktgröße und erhöht somit die perioperative Mortalität von Patienten, die eine Revaskularisierungstherapie erhalten [6, 7].Daher sind trotz des großen Erfolgs von Therapien zur Reduzierung postischämischer Kardiomyozytenverletzungen zusätzliche molekulare Studien und therapeutische Arzneimittel erforderlich, um die mikrovaskuläre Dysfunktion des Herzens während einer I/R-Verletzung anzugehen.Empagliflozin ist ein Inhibitor des Natrium/Glukose-Cotransporters 2. Basierend auf den Ergebnissen der EMPA-REG OUTCOME-Studie wurde Empagliflozin ursprünglich zur Behandlung von Typ-2-Diabetes in der klinischen Praxis eingesetzt [8].Basierend auf den vielversprechenden Ergebnissen der EMPEROR-Reduced-Studie [9] und der EMPEROR-Preserved-Studie [10] hat die US-amerikanische Food and Drug Administration Empagliflozin jedoch auch für die breitere Behandlung von Herzinsuffizienz unabhängig vom Diabetesstatus zugelassen.Es wurde intensiv geforscht, um das kardioprotektive Potenzial von Empagliflozin zu erklären, und über die entzündungshemmenden [11], antioxidativen [12], antiapoptotischen [13] und metabolischen [14] Wirkungen von Empagliflozin wurde vielfach berichtet.Diese molekularen Mechanismen, zusätzlich zu den hypoglykämischen Wirkungen, könnten die Mittel sein, durch die Empagliflozin die Kardiomyozytenstruktur/-funktion verbessert und somit die Häufigkeit schwerer kardiovaskulärer Ereignisse bei Patienten mit Herzinsuffizienz unterdrückt [15, 16].Noch wichtiger ist, dass mehrere Studien [17,18,19] gezeigt haben, dass Empagliflozin die Endothelzellfunktion unabhängig vom Diabetesstatus schützen kann.Die vorteilhafte Wirkung von Empagliflozin auf die mikrovaskuläre Herzfunktion wurde auch durch nicht-invasive Doppler-Ultraschallbildgebung zur Beurteilung der koronaren Flussgeschwindigkeitsreserve bestätigt [20].Trotz dieser aufregenden Ergebnisse sind die Wirkungen von Empagliflozin auf die mikrovaskuläre I/R-Verletzung des Herzens noch nicht vollständig geklärt.Viele Studien haben mitochondriale Schäden als einen zentralen pathogenen Beitrag zur I/R-Verletzung-induzierten kardialen mikrovaskulären Dysfunktion identifiziert [21,22,23].Von Mitochondrien stammende Superoxide induzieren die Oxidation von Tetrahydrobiopterin zu Dihydrobiopterin, was verhindert, dass Tetrahydrobiopterin an die endotheliale Stickoxidsynthase (eNOS) bindet, wodurch eNOS entkoppelt und die Stickoxidproduktion reduziert wird [24].Wenn mitochondriale pro-apoptotische Proteine ​​wie Cytochrom c und Smac das Cytosol infiltrieren, aktivieren sie außerdem Mitglieder der Caspase-Familie, um die Apoptose zu fördern [25].Mitochondrien sind auch an der Endothelmobilisierung, Seneszenz, Wachstum und Proliferation beteiligt [26,27,28].Es ist heute anerkannt, dass eine mitochondriale strukturelle Störung einer mitochondrialen Dysfunktion vorausgeht [29, 30].Eine erhöhte mitochondriale Spaltung reduziert das mitochondriale Membranpotential (MMP), erhöht die Produktion von mitochondrialen reaktiven Sauerstoffspezies (mtROS) und aktiviert mitochondrienabhängige apoptotische Wege während einer mikrovaskulären I/R-Verletzung des Herzens [30, 31].Interessanterweise haben unsere früheren Forschungen und andere Studien gezeigt, dass Empagliflozin die mitochondriale Spaltung hemmt, indem es die Phosphorylierung des Dynamin-verwandten Proteins 1 (Drp1) unterdrückt [32,33,34].Die endotheliale mitochondriale Spaltung wird jedoch nicht nur durch die Phosphorylierung von Drp1, sondern auch durch das mitochondriale Spaltungsprotein 1 (Fis1) [35] und/oder den mitochondrialen Spaltungsfaktor (Mff) [36] induziert.Es ist wenig bekannt, ob Empagliflozin die Fis1- oder Mff-Phosphorylierung bei mikrovaskulären I/R-Schäden des Herzens verändert.Kürzlich berichteten wir, dass die Fis1-Phosphorylierung ein wesentlicher Schritt bei der mitochondrialen Spaltung ist[37].Oxidativer Stress fördert DNA-Schäden [38, 39] und aktiviert somit die DNA-abhängige katalytische Untereinheit der Proteinkinase (DNA-PKcs), die an Fis1 bindet und es phosphoryliert.Phosphoryliertes Fis1 hat eine erhöhte Affinität zu zytosolischem Drp1, unabhängig davon, ob Drp1 phosphoryliert ist [35].Angesichts der antioxidativen Aktivität von Empagliflozin stellten wir die Hypothese auf, dass Empagliflozin die DNA-PKcs-induzierte Fis1-Phosphorylierung in Endothelzellen verhindern und so die mitochondriale Spaltung hemmen, die Endothelfunktion verbessern und mikrovaskuläre I/R-Verletzungen lindern kann.Alle experimentellen Verfahren, an denen Tiere beteiligt waren, wurden vom University of Wyoming College of Health Sciences und dem Chinese PLA General Hospital genehmigt, durchgeführt in Übereinstimmung mit den Animal Use Guidelines des Chinese PLA General Hospital und im Einklang mit dem National Institutes of Health Guide for the Care and Verwendung von Labortieren (NIH-Veröffentlichung Nr. 85-23).12 Wochen alte männliche C57BL/6J-Mäuse wurden mit inhaliertem Isofluran (1,5–2 %) anästhesiert, intubiert und mit einem Kleintierbeatmungsgerät (Harvard Apparatus) beatmet.Dann wurde eine linke Thorakotomie durchgeführt, um das Herz freizulegen, und die linke vordere absteigende Koronararterie wurde mit einer 8,0-chirurgischen Seidennaht für 45 Minuten ligiert, um eine Ischämie zu induzieren, gefolgt von 2 Stunden Reperfusion, wie wir zuvor berichtet haben [40].Empagliflozin (10 mg/kg/d) wurde gemäß einer früheren Studie sieben Tage lang vor einer I/R-Myokardverletzung verabreicht [32].Herzgewebe (Infarktzone) wurde in ein Fixiermittel (2,5 % Glutaraldehyd) getaucht und über Nacht bei 4 °C gelagert.Die Proben wurden dann verarbeitet und analysiert, wie wir zuvor beschrieben haben [41].Herzgewebe (Infarktzone) wurden in Paraffin eingebettet und entparaffiniert, wie für Hämatoxylin- und Eosin-Färbung.Die Schnitte wurden 20 min lang bei Raumtemperatur in eine 3%ige H2O2-Methanollösung gelegt, um endogenes Wasserstoffperoxid zu inaktivieren.Zur Demaskierung von Antigenen wurden die Schnitte 15 min in 10 mmol/L Citratpuffer, pH 6,0, mikrowellenbehandelt.Dann wurde eine Immunfärbung unter Verwendung des Avidin:biotinyliertes-Enzym-Komplex-Verfahrens mit einem Antikörper gegen ICAM1 (1:500, Abcam, #179707) durchgeführt.Nach dem Waschen wurden die Scheiben mit einem geeigneten Biotin-konjugierten sekundären Antikörper eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert, und dann wurde die Farbe unter Verwendung von 3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochlorid als Chromogen entwickelt.Die Schnitte wurden mit Gill-2-Hämatoxylin (Thermo-Shandon, Pittsburgh, PA, USA) gegengefärbt.Nach dem Färben wurden die Schnitte in steigenden Konzentrationen von Ethanol und Xylol dehydriert.Immunhistochemische Färbebilder wurden mit Aperio ImageScope v12.32.8013 (Leica Biosystems) analysiert.HCAECs (American Type Culture Collection, PCS-100-020™) wurden mit vaskulärem Basalzellmedium kultiviert, das 5 ng/ml vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor, 5 ng/ml epidermalen Wachstumsfaktor, 5 ng/ml fibroblastischen Wachstumsfaktor, 15 ng/ml enthielt. ml insulinähnlicher Wachstumsfaktor 1, 10 mM L-Glutamin, 0,75 U/ml Heparinsulfat, 1 µg/ml Hydrocortison, 50 µg/ml Ascorbinsäure, 1 % Amphotericin B, 1 % Penicillin-Streptomycin und 10 % fötales Rinderserum .Hypoxie/Reoxygenierung wurde verwendet, um eine sI/R-Verletzung in vitro zu induzieren.Kurz gesagt, das Medium wurde zu einer Ischämie nachahmenden Lösung geändert, die 5 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethansulfonsäure, 10 mM 2-Desoxy-D-glucose, 139 mM NaCl, 12 mM KCl, 0,5 mM MgCl 2 enthielt , 1,3 mM CaCl2 und 20 mM Milchsäure, pH 6,2, und dann wurden die Zellen unter 100 % Stickstoff (O2 < 1 %) bei 37 °C für 45 min inkubiert.Die Kulturen wurden dann wieder für 2 h auf normale Kulturbedingungen (10 % fötales Rinderserum, 37 °C Umgebungsluft, 5 % CO2) gebracht.Empagliflozin (10 µM) wurde den HCAECs 12 h vor der sI/R-Verletzung zugesetzt.Zur Induktion von oxidativem Stress wurden HCAECs sechs Stunden lang mit 0,3 mM Wasserstoffperoxid behandelt.NAC (10 mM) wurde dem Medium von HCAECs hinzugefügt, um die durch oxidativen Stress induzierte DNA-PKcs-Aktivierung in Gegenwart von sI/R zu reduzieren, basierend auf einer früheren Studie [42].Gesamt-mRNA wurde unter Verwendung eines Gesamt-RNA-Kits (Omega) isoliert und unter Verwendung eines Reverse Transcription Kits (Vazyme) gemäß den Anweisungen des Herstellers revers transkribiert.Dann wurden die mRNA-Spiegel unter Verwendung von quantitativer PCR mit SYBR Green (Vazyme) bestimmt.Die Menge jeder cDNA relativ zur endogenen Kontrolle (β-Aktin) wurde unter Verwendung der 2-ΔΔCt-Methode berechnet.Die folgenden Primerpaare wurden verwendet: TNFα (Vorwärts, 5'-AGATGGAGCAACCTAAGGTC-3'; Rückwärts, 5'-GCAGACCTCGCTGTTCTAGC-3'), IL-6 (Vorwärts, 5'-CAGACTCGCGCCTCTAAGGAGT-3'; Rückwärts, 5'-GATAGCCGATCCGTCGAA -3'), MCP1 (Vorwärts, 5'-GGATGGATTGCACAGCCATT-3'; Rückwärts, 5'-GCGCCGACTCAGAGGTGT-3').Proteine ​​aus lysierten Zellen wurden über Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese fraktioniert und auf Nitrozellulosemembranen übertragen.Unspezifische Bindungsstellen wurden mit 5 % Rinderserumalbumin in Tris-gepufferter Salzlösung mit Tween 20 (TBST: 120 mM Tris-HCl [pH 7,4], 150 mM NaCl, 0,05 % Tween 20) für zwei Stunden bei Raumtemperatur blockiert.Die Blots wurden mit spezifischen Primärantikörpern (jeweils 1:1000 verdünnt) über Nacht bei 4 °C inkubiert.β-Aktin wurde als Ladekontrolle verwendet.Die Membranen wurden dann dreimal mit TBST gewaschen und mit Meerrettichperoxidase-konjugierten sekundären Antikörpern inkubiert.Proteine ​​wurden unter Verwendung des Immobilon™ Western Chemiluminescent HRP-Substrats (Millipore, USA) sichtbar gemacht.Die folgenden Antikörper wurden von Abcam bezogen: ET-1 (#ab178454), eNOS (#ab199956), p-eNOS (#ab215717), Fak (#ab40794), Src (#ab133283), Drp1 (#ab184247), Fis1 ( #ab156865), GAPDH (#ab8245), Tom20 (#ab186735), DNA-PKcs (#ab32566), F-Aktin (#ab130935) und Met (#ab51067).Die folgenden Antikörper wurden von Cell Signaling Technology bezogen: p-Drp1 (#4494), Mff (#86.668) und p-Mff (#49.281).Das MMP wurde unter Verwendung eines MMP-Assay-Kits (Solarbio, Peking, China) gemessen.Die Zellen wurden mit der einzigartigen Fluoreszenzsonde JC-1 bei 37 °C für 20 min gefärbt und dann zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen.Die Fluoreszenzintensität der Zellen wurde unter Verwendung eines Durchflusszytometers (BD FACSCalibur, NJ, USA) und eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops (Olympus, Japan) beobachtet.Dann wurde die durchschnittliche Fluoreszenzintensität von grünen Monomeren und roten Aggregaten bestimmt und das Verhältnis berechnet.MitoTracker™ wurde verwendet, um Veränderungen in der mitochondrialen Dynamik zu erkennen.Für die mitochondriale Markierung wurden die Zellproben mit einer 100 nM Lösung von MitoTracker™ Green FM (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) für 30 min bei 37 °C, 5 % CO2 inkubiert.Bilder wurden unter Verwendung eines konfokalen Nikon-Mikroskopsystems und einer Kamera (Nikon Instruments, NY, USA) erhalten.Der fluoreszierende Farbstoff und die Länge der Mitochondrien wurden mit der Software Image J gemessen.Wir haben aus jeder Gruppe 10 zufällige Fluoreszenzfelder ausgewählt.Um die mPTP-Öffnung zu verfolgen, behandelten wir HCAECs mit Tetramethylrhodaminethylester, basierend auf unserer vorherigen Studie.Das Fluoreszenzsignal von Tetramethylrhodaminethylester wurde unter Verwendung eines konfokalen Nikon-Mikroskopsystems und einer Kamera bestimmt.Eukaryotische Expressionsvektoren, die Drp1, Fis1, DNA-PKcs und Met codieren, wurden durch die Insertion von PCR-amplifizierten Fragmenten in einen pcDNA3-Vektor (Invitrogen, CA, USA) erzeugt.Serin 616 wurde durch Asparaginsäure ersetzt, um die Drp1-Phosphorylierungs-mimetische Mutante (Drp1S616D) zu etablieren.Threonin 34 wurde durch Asparaginsäure ersetzt, um die Fis1-Phosphorylierungs-mimetische Mutante (Fis1T34D) zu konstruieren.Für die lentivirale Produktion wurden HEK293T-Zellen mit rekombinanten lentiviralen Vektoren und einem pPACK Packaging Plasmid Mix (System Biosciences) unter Verwendung von MegaTran-Reagenz (OriGene, Peking, China) cotransfiziert.Die Zielzellen wurden nach Herstellerangaben mit den Lentiviren infiziert.siRNA gegen DNA-PKcs wurde gemäß unseren jüngsten Berichten etabliert und in Zellen transfiziert [37, 43].HCAECs wurden mit den angegebenen Plasmiden transfiziert.Nach 24 h wurden die Zellen mit eiskaltem Immunpräzipitationspuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure, 1 % Triton X-100 und 0,5 % Natriumdeoxycholat) lysiert, der Protease-Inhibitor-Cocktail-Tabletten enthielt (04693132001, Roche) und die Proben wurden bei 13.000 xg für 15 min zentrifugiert.Dann wurden die Zelllysate mit Protein-G-Agarose-Kügelchen (AA104307, Bestchrom) und den angegebenen Antikörpern über Nacht bei 4 °C inkubiert.Nach dem Waschen mit Immunpräzipitationspuffer wurden die Immunkomplexe gesammelt und unter Verwendung der angegebenen primären Antikörper und entsprechenden sekundären Antikörper immungeblottet.Clean-Blot IP Detection Reagent (21.230, Thermo Fisher Scientific) wurde verwendet, um Störungen durch denaturierte Immunpräzipitations-Antikörperfragmente zu verhindern.Die Proben wurden mit 4 % Paraformaldehyd fixiert und mit 0,1 % Saponin permeabilisiert.Die Zellen wurden dann mit primären Antikörpern und den entsprechenden sekundären Antikörpern inkubiert.Die Bilder wurden unter Verwendung eines konfokalen Mikroskops (LCS-SP8-STED, Leica) aufgenommen.Der TUNEL-Assay (Abcam, #ab66108) wurde basierend auf den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.MtROS-Spiegel in HCAECs wurden unter Verwendung eines Mitochondrial ROS Detection Assay Kit (Cayman, Kat.-Nr. 701.600) gemäß den Empfehlungen des Herstellers gemessen.Die Aktivitätsniveaus von DNA-PKcs (DNA-PK Kinase Enzyme System, Kat. Nr. #V4106, Promega Corporation, USA), Met (MET Kinase Enzyme System, Kat. Nr. #V3361, Promega Corporation), Caspase-3 ( Human Cleaved Caspase-3 ELISA Kit, Abcam, Nr. 220.655), mitochondrialer respiratorischer Komplex I (Complex I Enzyme Activity Microplate Assay Kit, Abcam, Nr. ab109721) und mitochondrialer respiratorischer Komplex II (Complex II Enzyme Activity Microplate Assay Kit, Abcam, Nr. ab109908). ) wurden nach den Protokollen der Hersteller für die jeweiligen Kits bestimmt.Die intrazelluläre ATP-Produktion wurde mit einem ATP-Assay-Kit (Abcam, Nr. 83.355) basierend auf dem Protokoll des Herstellers gemessen.Biochemische Serumanalyse.Serum-TnI (Elabscience, E-EL-M0086c), LDH-Aktivität (Laktatdehydrogenase (LDH)-Assay-Kit, Nanjing, Jiancheng, China) und Serum-Kreatinkinase-MB (CK-MB) (Kreatinkinase-MB-Isoenzym-Assay-Kit, Nanjing Jiancheng, China) wurden mit einem ATP-Assay-Kit (Abcam, Nr. 83.355) basierend auf dem Protokoll des Herstellers gemessen.Alle Daten in dieser Studie wurden verwendet, um die Mittelwerte und Standardabweichungen zu bestimmen.Der Student-t-Test wurde verwendet, um die Unterschiede zwischen zwei Gruppen zu bestimmen.Eine Einweg-Varianzanalyse wurde durchgeführt, um Unterschiede zwischen drei oder mehr Gruppen zu bewerten.Die Bonferroni-Analyse und die T2-Analyse von Tamhane wurden nach Bedarf durchgeführt.P-Werte < 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.Um die Wirkungen von Empagliflozin auf kardiale mikrovaskuläre Schäden während einer I/R-Verletzung zu beurteilen, behandelten wir Mäuse sieben Tage lang mit oder ohne Empagliflozin (10 mg/kg/d), bevor sie einer myokardialen I/R-Verletzung oder einer Scheinoperation unterzogen wurden.Dann verwendeten wir Elektronenmikroskopie, um die mikrovaskuläre Struktur zu beobachten.Bei Mäusen, die einer I/R-Verletzung ausgesetzt waren, wurden die Mikrogefäßwände verdickt und verengt;Die Behandlung mit Empagliflozin kehrte diese Veränderungen jedoch um (Abb. 1A).Empagliflozin reduziert durch I/R-Verletzungen verursachte mikrovaskuläre Herzschäden.Mäuse wurden 45 Minuten Ischämie ausgesetzt, gefolgt von zwei Stunden Reperfusion, um eine I/R-Herzverletzung zu induzieren.Empagliflozin (EMPA, 10 mg/kg/d) wurde sieben Tage lang vor einer myokardialen I/R-Verletzung verabreicht.Eine Elektronenmikroskopie wurde verwendet, um strukturelle Veränderungen in Herzmikrogefäßen nachzuweisen.Gelbe Pfeile zeigen die verdickte Wand und das verengte Lumen an.B, C. Immunfluoreszenz wurde verwendet, um Fibrin-Akkumulation in Mikrogefäßen nachzuweisen.D-, E-Proteine ​​wurden aus reperfundiertem Herzen isoliert und die Expression von Fibrin wurde durch Western-Blots bestimmt.F, G Herzproben wurden nach I/R-Verletzung für die immunhistochemische Analyse von ICAM1 gesammelt.H – J Gesamt-mRNA wurde aus reperfundierten Herzen isoliert, und die mRNA-Spiegel von IL-6, MCP-1 und TNFα wurden mittels quantitativer PCR bestimmt.Die Daten sind als Mittelwert ± SEM, n = 6 Mäuse pro Gruppe gezeigt.* p < 0,05Um festzustellen, ob die okkludierte Mikrozirkulation eine Mikrothrombusbildung induziert hatte, führten wir Immunfluoreszenzanalysen von Fibrin in den kardialen Mikrogefäßen durch.Wie erwartet war die Fibrinakkumulation in reperfundierten Herzen größer als in scheinoperierten Herzen (Fig. 1B, C).Empagliflozin verhinderte jedoch die Ablagerung von Fibrin in der Mikrozirkulation, was darauf hindeutet, dass dieses Medikament antithrombotische Wirkungen hat (Abb. 1B, C).Um diese Ergebnisse zu validieren, führten wir Western Blotting durch, das bestätigte, dass eine I/R-Verletzung die Fibrinakkumulation im Herzgewebe förderte, während Empagliflozin diese Veränderung umkehrte (Abb. 1D, E).Zusätzlich zur Lumenstenose kann die Expression von Adhäsionsfaktoren wie dem interzellulären Adhäsionsmolekül 1 (ICAM1) die Wahrscheinlichkeit einer Mikrothrombusbildung erhöhen.Wie in Fig. 1F, G, I/R gezeigt, erhöhte eine Verletzung die ICAM1-Expression auf der Oberfläche von Mikrogefäßen, während eine Empagliflozin-Supplementierung die Häufigkeit von ICAM1 in der Mikrozirkulation verringerte.Hochregulierte Adhäsionsfaktoren und eine erhöhte Durchlässigkeit der Mikrogefäße können die Entzündungsreaktion während einer I/R-Verletzung stimulieren.Transkriptionsanalysen zeigten, dass eine I/R-Verletzung die mRNA-Spiegel von Interleukin 6 (IL-6), Tumornekrosefaktor alpha (TNFα) und Monozyten-Chemoattractant-Protein 1 (MCP1) erhöhte, während die Behandlung mit Empagliflozin die Transkription dieser Entzündungsfaktoren im Herzgewebe reduzierte (Abb 1H–J).Außerdem wurden die Spiegel von Herzverletzungsmarkern (wie TnI, CK-MB und LDH) auch durch EMPA in Gegenwart einer I/R-Verletzung normalisiert (Tabelle 1).Diese Ergebnisse zeigten, dass Empagliflozin die durch eine I/R-Verletzung verursachte mikrovaskuläre Dysfunktion des Herzens dämpft.Als nächstes bewerteten wir den Einfluss von Empagliflozin auf humane Endothelzellen der Koronararterie (HCAECs) nach einer simulierten I/R (sI/R)-Verletzung.In Anbetracht der Tatsache, dass das Gleichgewicht zwischen Endothelin 1 (ET-1) und eNOS die Endothel-abhängige Gefäßrelaxation fein abstimmt, haben wir Western Blotting verwendet, um die Expression dieser Proteine ​​in HCAECs zu untersuchen.Die Ergebnisse zeigten, dass sI/R die ET-1-Expression hochregulierte und die eNOS-Aktivität hemmte, während Empagliflozin das Gleichgewicht zwischen diesen beiden Proteinen in sI/R-behandelten HCAECs normalisierte (Abb. 2A–C).Src und fokale Adhäsionskinase (Fak), die Regulatoren der endothelialen Integrität und Barrierefunktion, wurden in HCAECs nach sI/R-Verletzung ebenfalls herunterreguliert, wurden aber nach der Behandlung mit Empagliflozin auf nahezu normalen Niveaus exprimiert (Abb. 2A–E).Empagliflozin erhält die mikrovaskuläre Endothelfunktion des Herzens nach I/R-Verletzung.HCAECs wurden einer 45-minütigen Hypoxie, gefolgt von einer zweistündigen Reoxygenierung, ausgesetzt, um in vitro eine sI/R-Verletzung zu induzieren.Die Zellen wurden mit Empagliflozin (EMPA, 10 &mgr;M) für 12 h vor der sI/R-Verletzung inkubiert.A–E Western Blotting wurde verwendet, um die Proteinspiegel von ET-1, p-eNOS, Fak und Src in HCAECs nach einer sI/R-Verletzung oder einer Behandlung mit Empagliflozin zu bestimmen.F, G FITC-Dextran-Clearance und TER-Assays wurden durchgeführt, um die Veränderungen der endothelialen Barrierefunktion und -integrität zu bestimmen.H, I Ein Immunfluoreszenzassay wurde verwendet, um Zytoskelettveränderungen in HCAECs nach einer sI/R-Verletzung zu beobachten.J-L-Western-Blotting wurde verwendet, um die F-Aktin-Proteinspiegel in HCAECs nach einer sI/R-Verletzung oder einer Behandlung mit Empagliflozin zu bestimmen.M Ein ELISA wurde verwendet, um die Aktivität von Caspase-3, einem Marker für Zellapoptose, zu bestimmen.Der N-TUNEL-Assay wurde verwendet, um die Anzahl apoptotischer Endothelzellen in Gegenwart von sI/R zu beobachten.Die Daten sind als Mittelwert ± SEM, n = zehn unabhängige Zellisolierungen pro Gruppe gezeigt.* p < 0,05Um die Auswirkungen von Empagliflozin auf die Barrierefunktion und -integrität weiter zu untersuchen, führten wir Assays zur Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-Dextran-Clearance und zum transendothelialen elektrischen Widerstand (TER) durch.Der verbleibende FITC-Dextran-Gehalt in HCAECs war nach einer sI/R-Verletzung signifikant erhöht, was darauf hinweist, dass die endotheliale Hyperpermeabilität die FITC-Dextran-Akkumulation beschleunigte (Abb. 2F–G).Darüber hinaus war der TER-Wert bei sI/R-behandelten HCAECs reduziert, was zeigt, dass die endothelialen Gap Junctions geschwächt waren.Die Verabreichung von Empagliflozin reduzierte nicht nur die Ablagerung von FITC-Dextran, sondern erhöhte auch den TER-Wert (Abb. 2F–G), was darauf hindeutet, dass Empagliflozin die Funktion und Integrität der endothelialen Barriere schützen kann.Frühere Forschungen haben gezeigt, dass der Abbau des Zytoskeletts, der aus der Depolymerisation von F-Aktin zu G-Aktin resultiert, ein frühes Anzeichen einer endothelialen Dysfunktion ist, da er die Zellmobilisierung beeinträchtigt und die Apoptose stimuliert [44].Bei HCAECs, die einer sI / R-Verletzung ausgesetzt waren, wurde das F-Aktin-Zytoskelett desorganisiert (Abb. 2H, I) und die F-Aktin-Expression war reduziert (Abb. 2J–L).Andererseits wurden bei mit Empagliflozin behandelten sI/R-geschädigten HCAECs ein wohlgeordnetes F-Aktin-Zytoskelett (Abb. 2H, I) und erhöhte F-Aktin-Spiegel (Abb. 2J–L) nachgewiesen.Die Aktivität des Apoptosemarkers Caspase-3 nahm bei sI/R-Verletzung zu, nahm jedoch nach Behandlung mit Empagliflozin ab (Abb. 2M).In Übereinstimmung mit dieser Beobachtung zeigten Analysen der terminalen Desoxynukleotidyltransferase dUTP-Nick-End-Markierung (TUNEL), dass die Anzahl apoptotischer HCAECs bei sI/R-Stress zunahm und in Gegenwart von Empagliflozin abnahm ( 2N , O).Diese Ergebnisse zeigten, dass Empagliflozin die HCAEC-Funktion während einer sI/R-Verletzung aufrechterhält.Eine Mitochondrienschädigung wurde während einer sI/R-Verletzung mit einer endothelialen Dysfunktion in Verbindung gebracht [Abb.3, 4].Daher untersuchten wir die Wirkungen von Empagliflozin auf die endotheliale Mitochondrienfunktion.Wir fanden heraus, dass eine sI/R-Verletzung die mtROS-Produktion auslöste, während die Empagliflozin-Behandlung übermäßige mtROS in HCAECs neutralisierte (Abb. 3A, B).Oxidativer Stress kann das mitochondriale Genom schädigen.Wie in Abb. 3 C, D, sI/R gezeigt, reduzierte eine Verletzung die mitochondriale DNA-Kopienzahl und Transkription in HCAECs, während die Behandlung mit Empagliflozin diese Wirkungen abschwächte.Da die mitochondrialen Atmungskomplexe teilweise durch mitochondriale DNA codiert werden, haben wir die Aktivitätsniveaus der mitochondrialen Atmungskomplexe I und II gemessen.Die Aktivitäten dieser beiden Komplexe in HCAECs waren bei einer sI/R-Verletzung reduziert, wurden aber nach einer Empagliflozin-Supplementierung aufrechterhalten (Abb. 3E, F).Empagliflozin stellt die mitochondriale Homöostase in Endothelzellen wieder her.HCAECs wurden einer 45-minütigen Hypoxie, gefolgt von einer zweistündigen Reoxygenierung, ausgesetzt, um in vitro eine sI/R-Verletzung zu induzieren.Die Zellen wurden mit Empagliflozin (EMPA, 10 &mgr;M) für 12 h vor der sI/R-Verletzung inkubiert.A, B. Die mtROS-Spiegel in HCAECs wurden mit einem Mitochondrial ROS Detection Assay Kit gemessen.C, D qPCR wurde verwendet, um die Veränderungen der mitochondrialen Kopie und Transkription zu analysieren.E, F ELISAs wurden verwendet, um Veränderungen in den mitochondrialen Atmungskomplexen I und II nachzuweisen.G, H Das MMP wurde unter Verwendung eines MMP-Assaykits mit der JC-10-Fluoreszenzsonde gemessen.Die ATP-Produktion wurde mit einem ELISA gemessen.J Die mPTP-Öffnungsrate wurde unter Verwendung eines Tetramethylrhodaminethylester-Fluoreszenzassays bestimmt.Die Daten sind als Mittelwert ± SEM, n = zehn unabhängige Zellisolierungen pro Gruppe gezeigt.* p < 0,05Das mitochondriale Membranpotential (MMP) wird hauptsächlich durch die Elektronenübertragung durch die mitochondrialen Atmungskomplexe bestimmt.Wir fanden heraus, dass eine sI/R-Verletzung das MMP depolarisierte, während Empagliflozin das MMP in sI/R-behandelten HCAECs stabilisierte (Abb. 3G, H).Da das MMP die Synthese von Adenosintriphosphat (ATP) antreibt, haben wir auch die ATP-Produktion bewertet.Die ATP-Spiegel waren bei sI/R-behandelten HCAECs reduziert;die Empagliflozin-Supplementierung behielt jedoch die normale Energieabgabe nach einer sI/R-Verletzung bei (Abb. 3I).Darüber hinaus ist die ATP-Reduktion auch ein Ergebnis der Hyperpermeabilität der Mitochondrienmembran.Wir fanden heraus, dass sI/R die Öffnung der mitochondrialen Permeabilitätsübergangspore (mPTP) (Abb. 3J) in HCAECs förderte, während Empagliflozin diese hemmte. Diese Ergebnisse zeigten, dass Empagliflozin die mitochondriale Funktion in HCAECs unter sI/R-Stress erhält.Unsere früheren Studien identifizierten die mitochondriale Spaltung als ein erstes Signal einer mitochondrialen Dysfunktion [45,46,47].Daher fragten wir uns, ob Empagliflozin die mitochondriale Homöostase aufrechterhalten könnte, indem es die mitochondriale Spaltung in HCAECs hemmt.Immunfluoreszenzanalysen der mitochondrialen Struktur zeigten, dass HCAECs, die einer sI/R-Verletzung ausgesetzt waren, fragmentierte und runde Mitochondrien enthielten (Abb. 4A–C).Die Behandlung mit Empagliflozin verlängerte die Mitochondrien und bewahrte die stark vernetzten mitochondrialen Netzwerke in HCAECs (Abb. 4A–C).Auf molekularer Ebene wird die mitochondriale Spaltung hauptsächlich durch Drp1 und seine Rezeptoren, einschließlich Mff und Fis1, induziert [48].Western Blotting zeigte, dass eine sI/R-Verletzung die Drp1-Phosphorylierung und die Fis1-Phosphorylierung induzierte, aber keinen Einfluss auf die Mff-Phosphorylierung hatte (Abb. 4D–G).Die Behandlung mit Empagliflozin hemmte nicht nur die Phosphorylierung von Drp1, sondern auch von Fis1 (Abb. 4D–G).Empagliflozin unterdrückt die mitochondriale Spaltung durch Hemmung der Fis1-Phosphorylierung.HCAECs wurden einer 45-minütigen Hypoxie, gefolgt von einer zweistündigen Reoxygenierung, ausgesetzt, um in vitro eine sI/R-Verletzung zu induzieren.Die Zellen wurden mit Empagliflozin (EMPA, 10 &mgr;M) für 12 h vor der sI/R-Verletzung inkubiert.A–C MitoTracker™ wurde verwendet, um Veränderungen in der mitochondrialen Dynamik zu erkennen.Die Anzahl der Kardiomyozyten mit fragmentierten Mitochondrien sowie die durchschnittliche Länge der Mitochondrien wurden aufgezeichnet.Mindestens 100 Mitochondrien von 10 HCAECs wurden verwendet, um die Anzahl von HCAECs mit fragmentierten Mitochondrien zu bewerten.D-G-Western-Blotting wurde verwendet, um die p-Drp1-, p-Fis1- und p-Mff-Proteinspiegel in HCAECs nach einer sI/R-Verletzung oder einer Behandlung mit Empagliflozin zu bestimmen.H-J-Western-Blotting wurde verwendet, um zytoplasmatische und mitochondriale Drp1-Proteinspiegel zu bestimmen.HCAECs wurden mit einer Drp1-Phosphorylierungs-mimetischen Mutante (Drp1S616D) oder einer Fis1-Phosphorylierungs-mimetischen Mutante (Fis1T34D) in Gegenwart von Empagliflozin transfiziert.K–L Die Bindung zwischen Drp1 und Fis1 wurde mit einem Co-Immunopräzipitationsassay in Gegenwart von Empagliflozin bestimmt.HCAECs wurden mit Drp1S616D oder Fis1T34D transfiziert.M-O-Immunfluoreszenzfärbung wurde verwendet, um die mitochondriale Morphologie in mit Drp1S616D oder Fis1T34D transfizierten HCAECs zu beobachten.Die Daten sind als Mittelwert ± SEM, n = zehn unabhängige Zellisolierungen pro Gruppe gezeigt.* p < 0,05Die Phosphorylierung von Drp1 beschleunigt seine Translokation aus dem Zytoplasma an die Oberfläche der Mitochondrien [49].Andererseits erhöht die Phosphorylierung von Fis1 seine Affinität zum zytoplasmatischen Drp1 [35].Um zu bestimmen, ob Empagliflozin die mitochondriale Spaltung durch einen oder beide dieser Mechanismen unterdrückt, verwendeten wir eine phosphorylierungsmimetische Drp1-Mutante (Drp1S616D, bei der Serin 616 durch Asparaginsäure ersetzt wurde, um p-Drp1Ser616 nachzuahmen) und eine phosphorylierungsmimetische Fis1-Mutante (Fis1T34D , in der Threonin 34 durch Asparaginsäure ersetzt wurde, um p-Fis1Thr34 nachzuahmen).Wir transfizierten HCAECs mit diesen mutierten Konstrukten in Gegenwart von Empagliflozin und bewerteten dann die Drp1-Translokation (vom Zytoplasma zu den Mitochondrien) und die mitochondriale Spaltung nach einer sI/R-Verletzung.Bemerkenswert ist, dass die Fis1T34D-Transfektion die mitochondriale Drp1 (Mito-Drp1)-Expression in HCAECs verstärkte, trotz der Behandlung dieser Zellen mit Empagliflozin;die Drp1S616D-Transfektion hatte diesen Effekt jedoch nicht (Abb. 4H–J).Darüber hinaus zeigte ein Co-Immunopräzipitationsassay, dass Empagliflozin die Bindung zwischen Drp1 und Fis1 in sI/R-geschädigten HCAECs beeinträchtigte und dieser Effekt eher durch Fis1T34D als durch Drp1S616D-Transfektion aufgehoben wurde (Abb. 4K–L).Ein morphologischer Immunfluoreszenzassay von Mitochondrien zeigte, dass Empagliflozin die mitochondriale Spaltung in sI/R-behandelten HCAECs größtenteils unterdrückte.Die Transfektion von HCAECs mit Fis1T34D verhinderte, dass Empagliflozin die mitochondriale Spaltung hemmte;die Transfektion mit Drp1S616D hatte diesen Effekt jedoch nicht (Abb. 4M–O).Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Empagliflozin die mitochondriale Spaltung bei sI/R-Schädigung hauptsächlich durch Förderung der Fis1-Dephosphorylierung unterdrückt, obwohl Empagliflozin auch die Drp1-Dephosphorylierung induzieren kann.Um zu bestätigen, dass Fis1-Dephosphorylierung der Hauptmechanismus war, durch den Empagliflozin HCAECs und ihre Mitochondrien schützte, transfizierten wir entweder mit Empagliflozin behandelte HCAECs mit der Fis1T34D-Mutante oder transfizierten sI/R-geschädigte HCAECs mit einer Fis1-Phosphorylierungs-defekten Mutante (Fis1T34A, in der Threonin 34 wurde durch Alanin als negative Kontrollgruppe ersetzt).Dann bewerteten wir die mitochondriale Homöostase und die Endothelfunktion.Wie in 5A , B gezeigt, hatte die Empagliflozin-Verabreichung oder die Fis1T34A-Transfektion ähnliche Wirkungen bei der Aufrechterhaltung der MMP von sI/R-geschädigten HCAECs.Empagliflozin konnte jedoch die MMP von sI/R-geschädigten HCAECs, die mit Fis1T34D transfiziert waren, nicht aufrechterhalten ( 5A , B).Empagliflozin-Supplementierung hemmte auch die mtROS-Erzeugung (Abb. 5C, D) und verstärkte die ATP-Produktion (Abb. 5E) in sI/R-geschädigten HCAECs, während die Fis1T34D-Transfektion diese Effekte aufhob.Darüber hinaus unterdrückte Empagliflozin die Öffnungsrate der mitochondrialen Permeabilitätsübergangsporen (mPTP) nach sI/R-Verletzung in normalen HCAECs, aber nicht in HCAECs, die mit Fis1T34D transfiziert wurden ( 5F ).CAS PubMed-Artikel Google ScholarCAS PubMed-Artikel Google ScholarCAS PubMed-Artikel Google ScholarCAS PubMed-Artikel Google ScholarCAS PubMed-Artikel Google ScholarCAS PubMed-Artikel Google ScholarCAS PubMed-Artikel Google ScholarCAS PubMed-Artikel Google ScholarCAS PubMed-Artikel Google ScholarCAS PubMed-Artikel Google ScholarBasic Res Cardiol.CAS PubMed-Artikel Google ScholarCAS PubMed-Artikel Google ScholarCAS PubMed-Artikel Google ScholarCAS PubMed-Artikel Google ScholarCAS PubMed-Artikel Google ScholarCAS PubMed-Artikel Google ScholarBasic Res Cardiol.CAS PubMed-Artikel Google ScholarJ Am Heart Assoc.CAS PubMed-Artikel Google ScholarCAS PubMed-Artikel Google ScholarCAS PubMed-Artikel Google ScholarCAS PubMed-Artikel Google ScholarCAS PubMed-Artikel Google ScholarCAS PubMed-Artikel Google ScholarJ Cell Mol Med.CAS PubMed-Artikel Google ScholarCAS PubMed-Artikel Google ScholarCAS PubMed-Artikel Google ScholarBasic Res Cardiol.CAS PubMed-Artikel Google ScholarCAS PubMed-Artikel Google ScholarSie können 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