Vielen Dank für Ihren Besuch auf nature.com.Sie verwenden eine Browserversion mit eingeschränkter CSS-Unterstützung.Um die beste Erfahrung zu erzielen, empfehlen wir Ihnen, einen aktuelleren Browser zu verwenden (oder den Kompatibilitätsmodus im Internet Explorer zu deaktivieren).In der Zwischenzeit zeigen wir die Website ohne Stile und JavaScript an, um eine kontinuierliche Unterstützung zu gewährleisten.Cell Discovery Band 2, Artikelnummer: 15039 (2016 ) Diesen Artikel zitierenNitrilase1 wurde in Verbindung mit dem fragilen Histidin-Triadenprotein Fhit als Tumorsuppressor klassifiziert.Das Wissen über Nitrilase1 und seine Tumorsuppressorfunktion ist jedoch noch begrenzt.Während Nitrilase1 und Fhit in Säugetieren eigenständige Proteine ​​sind, sind sie in Drosophila melanogaster und Caenorhabditis elegans verschmolzen.Gemäß der Rosetta-Stone-Hypothese können Proteine, die in einem Organismus als Fusionsproteine ​​und in einem anderen Organismus als separate Proteine ​​kodiert sind, im selben Signalweg wirken.Obwohl eine direkte Wechselwirkung zwischen menschlicher Nitrilase1 und Fhit nicht gezeigt wurde, deutete unser früherer Befund, dass Fhit mit β-Catenin interagiert und seine transkriptionelle Aktivität im kanonischen Wnt-Weg unterdrückt, darauf hin, dass menschliche Nitrilase1 auch die Wnt-Signalübertragung moduliert.Tatsächlich bildet humane Nitrilase1 einen Komplex mit β-Catenin und LEF-1/TCF-4, unterdrückt die β-Catenin-vermittelte Transkription und zeigt zusammen mit Fhit eine additive Wirkung.Knockdown der menschlichen Nitrilase1 verstärkt die Wnt-Zielgenexpression.Darüber hinaus zeigen unsere Experimente, dass β-Catenin humane Nitrilase1 von LEF-1/TCF verdrängt und dadurch zur Aktivierung der Wnt-Target-Gentranskription beiträgt.Die inhibitorische Aktivität von menschlicher Nitrilase1 auf die Wnt-Signalgebung von Vertebraten wurde durch Repression der Wnt-induzierten Doppelachsenbildung in der Xenopus-Embryogenese bestätigt.In Übereinstimmung mit dieser Erkenntnis bindet das Drosophila-Fusionsprotein Drosophila NitFhit direkt an Armadillo und unterdrückt den Wingless-Signalweg in Reportergen-Assays.Genetische Experimente bestätigten die repressive Aktivität von Drosophila NitFhit auf die Wingless-Signalübertragung in der Imaginalscheibe des Drosophila-Flügels.Darüber hinaus zeigte die kolorektale Tumor-Microarray-Analyse eine signifikant reduzierte Expression von humaner Nitrilase1 in schlecht differenzierten Tumoren.Zusammengenommen stellt die Repression des kanonischen Wnt-Signalwegs einen neuen Mechanismus für die humane Nitrilase1-Tumorsuppressorfunktion dar.Humane Nitrilase1 (hNit1) wurde während der Charakterisierung des menschlichen fragilen Histidin-Triaden (Fhit)-Tumorsuppressorproteins erkannt, als festgestellt wurde, dass Fhit in D. melanogaster und C. elegans als C-terminales Fusionsprotein mit dem nicht verwandten Protein exprimiert wird Nitrilase (Nit).Sequenzalignments identifizierten hNit1 als das nächste Homolog der Nit-Domäne in den NitFhit-Fusionsproteinen von Drosophila und C. elegans, das etwa 50 % Identität auf Aminosäuresequenzebene innerhalb der Nit-Domäne aufweist [1].Das NitFhit-Fusionsprotein von C. elegans bildet einen tetrameren Komplex mit vier Nit-Domänen, die den zentralen Kern bilden, und den C-terminalen Fhit-Domänen, die sich als Dimere an gegenüberliegenden Stellen des Nit-Kerns ausrichten [2].Eine ähnliche dimere Struktur wurde zuvor für das menschliche Fhit-Protein berichtet [3].Darüber hinaus zeigen Fhit und Nit1 ähnliche Expressionsmuster [4].Basierend auf diesen Beobachtungen wurden Fhit und Nit1 als Rosetta-Stone-Proteine ​​definiert [5] mit einer postulierten gemeinsamen tumorunterdrückenden Funktion, obwohl eine direkte Interaktion beider Proteine ​​bisher nicht gezeigt wurde.Im Gegensatz zu Fhit ist über die Funktion von Nit1 wenig bekannt und Interaktionspartner wurden nicht untersucht.Zusammen mit Nitrilase2 und den NitFhit-Fusionsproteinen von D. melanogaster und C. elegans gehört Nit1 zum 10. von 13 Zweigen der Nit-Protein-Superfamilie.Es ist bekannt, dass nur Zweig-1-Enzyme eine spezifische Nitrilase-Aktivität aufweisen, die eine Nitrilhydrolyse durchführt, während die meisten anderen Zweige offensichtliche oder postulierte Amidase- oder Amid-Kondensationsaktivitäten aufweisen [6].Es wurde berichtet, dass Säugetier-Nit1 mehrere synthetische Dipeptidsubstrate spaltet, aber keine Amidase-Aktivität aufweist, wie für Säugetier-Nitrilase2 berichtet [7, 8].Bisher ist kein physiologisches Substrat von Nit1 bekannt.Nit1–/–-Mäuse entwickelten sich normal und zeigten ähnliche Phänotypen, wie sie für Fhit–/–-Mäuse berichtet wurden, wie beschleunigte Zellproliferation, erhöhte Cyclin-D1-Expression und höhere N-Nitrosomethylbenzylamin-induzierte Tumorinzidenz.Die Überexpression von Nit1 ähnlich der Fhit-Überexpression führte zu einer verstärkten Apoptose.Die Mutation des Cys-Restes innerhalb der katalytischen Triade hatte keinen Einfluss auf die tumorunterdrückende Aktivität von Nit1 [4].Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Nit1 als negativer Regulator der T-Zell-Proliferation wirkt [9].Interessanterweise induziert die Überexpression von Fhit die Apoptose in Nit1–/–-Zellen und umgekehrt, was darauf hindeutet, dass beide Proteine ​​die pro-apoptotische Signalübertragung unabhängig voneinander fördern können [4].Beim ösophagealen Adenokarzinom wurde in 48 % der Fälle ein Verlust der Nit1-Expression beobachtet, was auf eine Rolle bei der Krebsentstehung beim Menschen hindeutet [10].Allerdings korrelierten der Verlust der Nit1- und Fhit-Expression in dieser Studie nicht [10].Derzeit ist wenig über die Mechanismen der Tumorsuppressorfunktion von Nit1 bekannt.β-Catenin wirkt als multifunktionales Adapterprotein beispielsweise innerhalb des Cadherin-Catenin-Zell-Zell-Adhäsionskomplexes und im kanonischen Wnt-Signalweg und reguliert dadurch verschiedene zelluläre Prozesse, einschließlich Morphogenese, Proliferation, Differenzierung, Tumorentstehung und neurodegenerative Erkrankungen [11– 14].Dies erfordert, dass β-Cateninspiegel und -funktion streng kontrolliert werden müssen.Überschüssiges zytoplasmatisches β-Catenin wird durch den β-Catenin-Zerstörungskomplex, der aus dem Protein der adenomatösen Polyposis coli (APC), Axin, Disheveled und den Ser/Thr-Kinasen Caseinkinase 1 und Glykogensynthasekinase-3-β besteht, schnell für den Abbau markiert.Die Aktivierung des Wnt-Signalwegs durch Bindung sekretierter Mitglieder der Wnt-Familie an Frizzled/LRP6-Rezeptorkomplexe destabilisiert wiederum den Zerstörungskomplex und führt schließlich zur Akkumulation von β-Catenin im Cytosol und seiner Translokation in den Zellkern.Dort rekrutiert β-Catenin in Verbindung mit LEF-1/TCF-Transkriptionsfaktoren weitere Komponenten, darunter Bcl-9, Pygopus, Parafibromin und CREB-bindendes Protein, die die Transkription an Promotoren von Zielgenen wie c-myc, Cyclin D1, sp5 modulieren , Axin2, Survivin und MMP-14 [15].Zuvor haben wir β-Catenin als direkten Fhit-Interaktionspartner identifiziert [16, 17].Basierend auf dieser Beobachtung und im Zusammenhang mit einer mutmaßlichen Kooperation von Nit1 und Fhit, wie sie von der Rosetta-Stone-Hypothese [18] postuliert wird, haben wir uns hier mit der Frage beschäftigt, ob hNit1/Drosophila NitFhit (dNitFhit) eine modulatorische Rolle im kanonischen Wnt/Wingless ( Wg)-Weg sowohl durch biochemische als auch durch genetische Analysen.Um zu testen, ob hNit1 einen Komplex mit β-Catenin bilden kann, wurden Co-Immunopräzipitationsexperimente in HEK-293-Zellen durchgeführt, die transient mit β-Catenin-FLAG und hNit1-myc6 transfiziert wurden.Wie in Fig. 1a gezeigt, kopräzipitierte Anti-FLAG-M2-Antikörper hNit1-myc6 in Zellen, die mit beiden Konstrukten cotransfiziert wurden, aber nicht in Kontrollen, die nur mit einem einzigen Plasmid transfiziert wurden.Darüber hinaus war es mit dem monoklonalen Anti-Nit1 (1C3)-Antikörper möglich, endogene hNit1/β-Catenin-Komplexe aus Lysaten von HeLa- und HEK-293-Zellen auszufällen (Abbildung 1b).Ähnliche Ergebnisse wurden mit einem polyklonalen Anti-Nit1-Antikörper in HEK-293 HeLa-, HCT116- und MCF-7-Zellen (nicht gezeigt) erhalten.Proximity Ligation Assays (PLAs) [19] bestätigten ferner eine endogene Interaktion von β-Catenin und hNit1 innerhalb von MCF-7-Zellen.Der Knockdown von endogenem hNit1 reduzierte die PLA-Signale sowohl im Zytoplasma als auch im Zellkern signifikant (Abbildung 1c).Die Immunfluoreszenzmikroskopie zeigte auch eine zytosolische und nukleäre Lokalisierung von überexprimiertem hNit1 (ergänzende Abbildung S1).In nuklearen/zytosolischen Fraktionierungsexperimenten war überexprimiertes hNit1 überwiegend im Zytosol lokalisiert, wobei geringere Mengen im Zellkern lokalisiert waren.In diesen Assays veränderte die Überexpression die zytosolische/nukleare Verteilung von β-Catenin nicht (ergänzende Abbildung S2A).Interessanterweise nahm β-Catenin im Kern zu, als HEK-293-Zellen mit Wnt3a-konditioniertem Medium stimuliert wurden, und die Überexpression von hNit1 verringerte offenbar die Menge an nukleärem β-Catenin (ergänzende Abbildung S2B).Darüber hinaus wurde hNit1 aus Lysaten von HEK-293-Zellen, die mit FLAG-LEF-1 und hNit1 transfiziert waren, mitgefällt, was darauf hindeutet, dass hNit1 möglicherweise mit dem β-Catenin/LEF-1-Transkriptionskomplex assoziiert ist (ergänzende Abbildung S3).hNit1 interagiert mit β-Catenin.(a) FLAG-markiertes β-Catenin bildet einen Komplex mit myc6-markiertem hNit1 in Co-Immunpräzipitationsexperimenten mit Anti-FLAG-M2-Antikörper.(b) Endogene hNit1/β-Catenin-Komplexe können aus Lysaten von HeLa- und HEK-293-Zellen mit monoklonalem Anti-Nit1 (1C3)-Antikörper co-immunpräzipitiert werden.(c) PLAs unter Verwendung von monoklonalen Anti-Nit1 (1C3)- und polyklonalen Anti-β-Catenin (M14M)-Antikörpern bestätigen die intrazelluläre Wechselwirkung von hNit1 mit β-Catenin.shNit1, MCF-7-Klon 6, stabil transfiziert mit shNit1-Konstrukt;scr, MCF-7-Zellen, stabil transfiziert mit einem Scrambled Short Hairpin RNA (shRNA)-Kontrollkonstrukt;'—', beide Primärantikörper weggelassen.Alle Bilder sind repräsentativ für mindestens drei unabhängige Experimente.Lysatkontrollen sind in den unteren Feldern dargestellt.*Schwere Kette präzipitierender Antikörper.In diesem Zusammenhang haben wir als nächstes in Reportergen-Assays untersucht, ob hNit1 einen Einfluss auf die β-Catenin-vermittelte Transkriptionsaktivität hat.Die Transfektion steigender Mengen an hNit1 führte zu einer dosisabhängigen Hemmung der Aktivität des Reportergens pGL4.26BAR-luc [20] in HEK-293-Zellen.Die Mutation des Cys-Restes im katalytischen Zentrum des Proteins (hNit1C203A) beeinträchtigte die repressive Aktivität nicht (Abbildung 2a).Eine ähnliche repressive Aktivität von hNit1 war in SW480-Kolonkarzinomzellen nachweisbar, in denen der Wnt-Signalweg aufgrund einer Mutation in APC konstitutiv aktiv ist (ergänzende Abbildung S4).Vergleichbare Ergebnisse wurden erhalten, als Reportergen-Assays mit Siamois-Luciferase-Reportergenkonstrukten (S5 und S0) durchgeführt wurden, die einen endogenen Promotor eines bekannten β-Catenin-Zielgens enthielten [21] (Abbildung 2b, Spalten 1–3).Die durch ΔNLEF-VP16 induzierte Transkriptionsaktivierung, ein Konstrukt, das die β-Catenin-unabhängige Transkription über die VP16-Transaktivierungsdomäne des Herpes-simplex-Virus antreibt [22], wurde durch hNit1 nicht gehemmt (Abbildung 2b, Spalten 4–5), was darauf hinweist, dass hNit1 dies nicht getan hat eine allgemeine Hemmwirkung auf die Transkription, hängt jedoch von β-Catenin ab.Da berichtet wurde, dass Nit1 und Fhit additiv wirken [10], wollten wir uns als nächstes mit der Frage beschäftigen, ob ein additiver Effekt auch in Bezug auf die β-Catenin-vermittelte Transkription nachweisbar ist.Tatsächlich induzierte die Co-Transfektion sowohl von hNit1 als auch von hFhit eine weitere Repression (Fig. 2c).Interessanterweise führte die Expression eines künstlichen hNit1Fhit-Fusionskonstrukts, bei dem das hNit1-Protein mit hFhit durch ein Linkerpeptid aus dem dNitFhit-Fusionsprotein fusioniert wurde, zu einer ähnlichen repressiven Aktivität, wie sie für die co-exprimierten separaten Proteine ​​festgestellt wurde (ergänzende Abbildung S5).Darüber hinaus unterdrückte die Überexpression von hNit1 die Aktivierung des Reportergens als Reaktion auf die Wnt3a-Stimulation (Abbildung 2d).Wenn dagegen hNit1 durch stabile Transfektion eines kurzen Haarnadel-RNA-Konstrukts in MCF-7-Zellen niedergeschlagen wurde, wurde die Expression der endogenen Wnt-Zielgene sp5, Cyclin D1 (Abbildung 2e) und MMP-14 (ergänzende Abbildung S6) erhöht.Die Effizienz des Knockdowns wurde durch quantitative Reverse-Transkriptase-PCR (Abbildung 2e) und Western-Blotting (Abbildung 2f) in zwei verschiedenen Klonen analysiert.Um zu untersuchen, ob hNit1 an Promotoren von TCF/β-Catenin-Zielgenen rekrutiert wird, wurden Chromatin-Immunpräzipitationsexperimente durchgeführt, die zeigten, dass endogenes hNit1 tatsächlich mit den Cyclin D1- und MMP-14-Promotoren assoziiert ist (ergänzende Abbildung S7).Aus diesen Daten schließen wir, dass sowohl hNit1 als auch hFhit die β-Catenin-vermittelte Transkription auf additive Weise unterdrücken.HNit1 und hFhit unterdrücken die β-Catenin-vermittelte Transkription.HEK-293-Zellen wurden transient mit den jeweiligen Reportergenkonstrukten pGL4.26BARluc/pGL4.26fuBARluc oder pGL3Siamois-luc S5/S0 transfiziert.Die BAR-luc/fuBAR-luc-Reportergenexpression wurde durch Transfektion von TCF-4 und β-Catenin-Expressionsplasmiden aktiviert.Das phRL-Null-Renilla-Luciferase-Plasmid wurde verwendet, um die Transfektionseffizienz zu normalisieren.Die Luciferase-Aktivitäten wurden 24 h nach der Transfektion gemessen.Für alle Experimente werden mindestens drei unabhängige Transfektionen, die doppelt und ±sem gemessen wurden, präsentiert.(a) Wirkungen von hNit1 (0,5 μg oder 1 μg) und enzymatisch totem hNit1C203A (1 μg) auf die Transkriptionsaktivität von β-Catenin.(b) Siamois S5/S0-Reportergen-Aktivität ist nach Co-Transfektion von hNit1 in LEF-1/β-Catenin, aber nicht in ΔN-LEF-VP16-transfizierten Zellen reduziert.(c) Repression der BAR-luc-Aktivität, gemessen nach Transfektion von hNit1 und hFhit allein, und additive Wirkung nach Co-Transfektion beider Konstrukte.(d) Die Aktivität des Topflash/Fopflash-Reportergens wird durch hNit1 in Wnt3a-stimulierten Zellen unterdrückt.(e) Die Expression der endogenen Wnt-Zielgene sp5 und Cyclin D1 wird in hNit1-Knockdown-MCF-7-Zellen hochreguliert.Die relative mRNA-Expression wurde durch quantitative Reverse-Transkriptase-PCR analysiert.Zwei hNit1-Knockdown-Klone wurden analysiert (Klon 12, n = 4 ± sem; Klon 6, n = 1) und auf Werte normalisiert, die aus dem verschlüsselten Klon erhalten wurden.(f) Zelllysate wurden durch Western-Blotting analysiert.Als Beladungskontrolle wurde Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) verwendet.Als nächstes untersuchten wir, ob Nit1 auch als Repressor des kanonischen Wnt-Signalwegs in Wirbeltieren in vivo wirkt, indem wir die Sekundärachsenbildung in Xenopus laevis, einem Standardmodell zur Untersuchung der Wnt/β-Catenin-Signalübertragung, analysierten.Die Injektion von Wnt1-mRNA induziert typischerweise die Bildung der ektopischen Achse in Xenopus-Embryonen.Die Co-Injektion von hNit1-mRNA hob die Frequenz der Sekundärachsen stark auf (Abbildung 3a).Im Gegensatz dazu hatte die Co-Injektion von Prolaktin-mRNA als Kontrolle keine Wirkung (nicht gezeigt).Um diese Beobachtung weiter zu bestätigen, wurde ein Siamois-Luciferase-Reporterkonstrukt injiziert und die Aktivierung dieses Konstrukts als Reaktion auf die Co-Injektion von XWnt8+/–hNit1-mRNAs quantifiziert.In Übereinstimmung mit den Reportergen-Assays in transfizierten HEK-293-Zellen wirkt hNit1 als Repressor der Siamois-Promotor-abhängigen Transkription (Abbildung 3b).Diese Ergebnisse zeigen, dass hNit1 auch als Repressor der kanonischen Wnt-Signalgebung in vivo wirkt.HNit1 unterdrückt die Wnt1-induzierte Doppelachsenbildung in X. laevis-Embryonen.(a) Die Injektion von 5 pg mWnt1-mRNA in die Marginalzone von Xenopus-Embryonen im Vierzellstadium induzierte bei 71,4 % der injizierten Embryonen eine ektopische Achse.Dies ist am besten an der Y-förmigen Verdoppelung des Neuralrohrs zu erkennen.Die Co-Injektion von 500 pg hNit1 reduzierte die Häufigkeit der Sekundärachsenbildung auf 42,9 %.Beispiele für Embryonen, die eine gehemmte Bildung der Sekundärachse (+ Wnt1) zeigen, wenn hNit1-RNA injiziert wird.(b) Xenopus-Embryos wurden mit einem Siamois-Luciferase-Reporterplasmid und den angegebenen Kombinationen von hNit1- und XWnt8-mRNAs injiziert.Siamois-Promotor-abhängige Transkription wurde reduziert, wenn hNit1-mRNA co-injiziert wurde.Um zu untersuchen, ob die beobachtete repressive Wirkung von hNit1 durch eine direkte Wechselwirkung mit β-Catenin vermittelt wird, führten wir in-vitro-Assoziationsassays durch.Ein gereinigtes rekombinantes Glutathion-S-Transferase (GST)-β-Catenin-Fusionsprotein zog MBP (Maltose-bindendes Protein)-hNit1 herunter (Abbildung 4, Spur 6), was zeigt, dass die Wechselwirkung zwischen β-Catenin und hNit1 direkt ist.MBP-hNit1 band nicht an ein GST-ECT (E-Cadherin Cytoplasmic Tail)-Fusionsprotein als Negativkontrolle (nicht gezeigt).Unter Verwendung von N- und C-terminalen Deletionskonstrukten von β-Catenin wurde die Bindungsstelle für hNit1 auf die Armadillo-Repeat-Region von β-Catenin kartiert.Eine geringfügige Bindung von MBP-hNit1 an die C-terminale Domäne von β-Catenin war nachweisbar (Fig. 4).HNit1 bindet direkt an die Armadillo-Repeat-Region in β-Catenin.In-vitro-Pulldown-Assays wurden mit gereinigtem rekombinantem GST-β-Catenin und MBP-hNit1-Fusionsproteinen wie angegeben durchgeführt.GST und MBP wurden als Kontrolle verwendet.Deletionskonstrukte von β-Catenin (GST-β-cat (aa1–781); GST-β-cat-N-term (aa1–119); GST-β-cat-core (aa120–683) und GST-β- cat-C-term (aa683–781)) wurden verwendet, um die hNit1-Bindungsstelle in β-Catenin zu kartieren.Proteinkomplexe wurden mit Glutathion (GSH)-Agarose-Kügelchen isoliert und durch Western-Blotting mit einem monoklonalen Anti-MBP- oder einem polyklonalen Anti-GST-Antikörper analysiert.Das Bild ist repräsentativ für mindestens drei unabhängige Experimente.In einem nächsten Schritt wollten wir den Mechanismus untersuchen, durch den hNit1 die β-Catenin-Signalgebung unterdrückt.Die Überexpression von hNit1 veränderte die β-Catenin-Proteinspiegel innerhalb der Zellen nicht, was darauf hinweist, dass hNit1 die β-Catenin-Stabilität nicht beeinflusste (Abbildung 5a).Die Bindung von hNit1 an die Arm-Repeat-Domäne in β-Catenin legt nahe, dass hNit1 die Bildung von TCF/LEF-1/β-Catenin-Transkriptionskomplexen beeinträchtigt, die für die Aktivierung des Zielgens erforderlich sind.Um dies zu testen, wurden HEK-293-Zellen mit verschiedenen Kombinationen einer konstitutiv aktiven Mutante von β-Catenin (β-cat-S33A-myc6) und FLAG-TCF-4 zusammen mit hNit1 transfiziert.Nach der Immunpräzipitation mit Anti-FLAG-M2-Antikörper assoziiert hNit1 mit TCF-4 in Abwesenheit von cotransfiziertem β-Catenin-S33A-myc6 (Abbildung 5b, Spur 2) in Übereinstimmung mit dem in der ergänzenden Abbildung S1A gezeigten Befund, dass sich hNit1 bildet ein Komplex mit LEF-1.Wenn jedoch β-Catenin-S33A-myc6 cotransfiziert wurde, wurden nur geringe Mengen von hNit1 mit FLAG-TCF-4 copräzipitiert (Fig. 5b, Spur 5).Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn Lysate von HEK-293-Zellen, die mit FLAG-TCF-4 und hNit1 cotransfiziert waren, vor der Immunpräzipitation mit gereinigtem rekombinantem β-Catenin-His6 inkubiert wurden.Die Zugabe von β-Catenin-His6 reduzierte die Assoziation von hNit1 mit TCF-4 signifikant (Abbildung 5c).Diese Beobachtungen legten nahe, dass hNit direkt an TCF/LEF-Transkriptionsfaktoren binden kann und dass β-Catenin und hNit1 um die Bindung an TCF-4 konkurrieren.Pulldown-Assays mit gereinigtem rekombinantem GST-LEF-1 und MBP-Nit1 zeigten eine direkte Wechselwirkung von LEF-1 und Nit1 (Abbildung 5d).Darüber hinaus wurde die Konkurrenz um LEF-1 in Pulldown-Assays mit gereinigten rekombinanten GST-LEF-1-, β-Catenin-His6- und MBP-hNit1-Proteinen bestätigt.Ein GST-LEF-1/β-Catenin-His6-Komplex wurde vorgebildet und durch Pulldown von GST-LEF-1 mit Glutathion-Agarose-Kügelchen isoliert.Nach dem Waschen wurden die Komplexe mit zunehmenden Mengen an MBP-hNit1 inkubiert und erneut gewaschen.Die Zugabe von MBP-hNit1 führte zu einer erhöhten Bindung von MBP-hNit1 an GST-LEF-1 und einer gleichzeitigen Freisetzung von β-Catenin-His6 in den Überstand (Fig. 5e).HNit1 bindet an LEF-1/TCF-4 und konkurriert mit β-Catenin.(a) Die vorübergehende Überexpression von hNit1 beeinflusst die Gesamt-β-Catenin-Spiegel in HEK-293-Zellen nicht.Als Beladungskontrolle wurde Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) verwendet.(b) Co-Transfektion von β-Catenin entfernt hNit1 von TCF-4.HEK-293-Zellen wurden wie angegeben transient mit β-Catenin-S33A-myc6, FLAG-TCF-4 und hNit1 transfiziert.Co-Immunpräzipitationen wurden mit Anti-FLAG-M2-Antikörper durchgeführt und präzipitierte Proteinkomplexe wurden durch Western-Blotting mit Anti-hNit1- oder Anti-myc (9E10)-Antikörpern analysiert.Lysatkontrollen sind in den unteren Feldern gezeigt.**Schwere Kette.(c) β-Catenin-His6 dissoziiert hNit1/TCF-4-Komplexe in Zelllysaten.HEK-293-Zellen wurden mit FLAG-TCF-4 und/oder hNit1 transfiziert und 48 h nach der Transfektion lysiert.Gereinigtes rekombinantes β-Catenin-His6 wurde wie angegeben zu dem Lysat gegeben und anschließend wurde eine Immunpräzipitation mit dem Anti-FLAG-M2-Antikörper durchgeführt.Isolierte Proteinkomplexe wurden durch Western Blotting mit dem Anti-hNit1-Antikörper analysiert.(d) HNit1 interagiert direkt mit LEF-1.Die Bindung von GST-LEF-1 an MBP-hNit1 wurde in Pulldown-Assays analysiert.Proteinkomplexe wurden mit Glutathion (GSH)-Agarose-Kügelchen isoliert und anschließend durch Western-Blotting mit einem Anti-MBP-Antikörper analysiert.GST und MBP wurden als Kontrolle verwendet.(e) MBP-hNit1 dissoziiert vorgeformte gereinigte GST-LEF-1/β-Catenin-His6-Komplexe.Gleichzeitig mit steigenden Mengen an MBP-Nit1 bindet mehr MBP-Nit1 an GST-LEF-1 und β-Catenin-His6 wird in den Überstand freigesetzt (unterer Blot).Der mittlere Blot ist identisch mit dem Blot im oberen Bild, der nach erster Behandlung mit Anti-MBP-Antikörper gewaschen und anschließend mit Anti-β-Catenin-Antikörper behandelt wurde.(f) HNit1, das mit FLAG-ΔNTCF-4 assoziiert ist, wird nicht durch β-Catenin dissoziiert.Jedes Experiment wurde mindestens dreimal durchgeführt.In Bezug auf die beobachtete Konkurrenz befassten wir uns als nächstes damit, ob hNit1 an die N-terminale β-Catenin-Bindungsdomäne in LEF-1/TCF bindet [23–25].Interessanterweise zeigte hNit1 in Co-Immunpräzipitationsexperimenten aus Lysaten von HEK-293-Zellen, die vorübergehend entweder mit FLAG-TCF-4 oder einem N-terminal deletierten FLAG-ΔNTCF-4-Konstrukt transfiziert wurden, eine stärkere Bindung an das N-terminal deletierte TCF- 4-Konstrukt als zum TCF-4 voller Länge (Fig. 5f, Bahnen 5 und 6).Darüber hinaus beeinträchtigte die Koexpression von β-Catenin-S33A-myc6 die Bindung von hNit1 an TCF-4 in voller Länge, wie oben gezeigt, während β-Catenin-S33A-myc6 nicht in der Lage war, die Wechselwirkung von hNit1 mit ΔNTCF-4 zu unterbrechen ( Abbildung 5f, Spuren 7 und 8).Zusammengenommen legen diese Daten nahe, dass hNit1 in Verbindung mit LEF-1/TCF-Transkriptionsfaktoren als Co-Repressor der kanonischen Wnt-Signalgebung wirken kann und steigende Konzentrationen von β-Catenin hNit1 von LEF-1/TCF-Transkriptionsfaktoren wegtitrieren.Um diese Beobachtungen weiter zu bestätigen und zu entschlüsseln, ob die Hemmung der Wnt/β-Catenin-Signalübertragung durch NitFhit ein evolutionär konservierter Mechanismus ist, untersuchten wir, ob das dNitFhit-Fusionsprotein den Wg-Signalweg in ähnlicher Weise beeinflusst.In dieser Hinsicht analysierten wir, ob dNitFhit mit dem Drosophila-β-Catenin-Homolog Armadillo in Co-Immunpräzipitationsexperimenten mit Lysaten aus HEK-293-Zellen assoziiert, die transient mit dNitFhit-myc6 und Armadillo-3xFLAG allein oder in Kombination transfiziert wurden.DNitFhit/Gürteltier-Komplexe waren leicht in Zellen nachweisbar, die mit beiden Konstrukten transfiziert wurden, aber nicht, wenn sie mit einem einzelnen Konstrukt als Kontrolle transfiziert wurden (Abbildung 6a, Bahnen 1–3).In einem nächsten Schritt wollten wir untersuchen, welche Domäne von dNitFhit die Bindung an Armadillo vermittelt.Zu diesem Zweck transfizierten wir HEK-293-Zellen mit FLAG3-markiertem Armadillo und entweder der myc6-markierten dNit- oder dFhit-Domäne von dNitFhit.Bei Immunpräzipitationen mit einem Anti-FLAG-Antikörper wurden sowohl die dFhit- als auch die dNit-Domäne gemeinsam präzipitiert (Abbildung 6a, Bahnen 4–9).Darüber hinaus bildete dNitFhit in Co-Immunpräzipitationsexperimenten auch einen Komplex mit β-Catenin (ergänzende Abbildung S8A), was darauf hindeutet, dass diese Wechselwirkung in der Evolution stark konserviert ist.Um zu beweisen, dass diese Wechselwirkung direkt ist, wurden Pulldown-Assays mit gereinigten rekombinanten Fusionsproteinen durchgeführt.In diesen Experimenten war MBP-dNitFhit spezifisch mit GST-Gürteltier und GST-β-Catenin assoziiert, jedoch nicht mit GST allein (ergänzende Abbildung S8B und C).Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass dNitFhit bei der Bildung eines Komplexes mit Armadillo die Wg-Signalübertragung in Drosophila modulieren kann, wie oben für hNit1 gezeigt.Das Rosetta-Stone-Fusionsprotein dNitFhit bindet an Armadillo und β-Catenin und unterdrückt die Wg-vermittelte Transkription.(a) FLAG3-Gürteltier und dNitFhit-myc6 bilden einen Komplex in Co-Immunpräzipitationen aus Lysaten transient transfizierter HEK-293-Zellen.Eine ähnliche Komplexbildung wurde für die allein exprimierte dNit- und dFhit-Domäne beobachtet.Proteinkomplexe wurden durch Western-Blotting mit Anti-myc (9E10)-Antikörper analysiert.Lysatkontrollen sind in den unteren Feldern gezeigt.*Leichtketten, **Schwerketten des präzipitierenden Antikörpers.(b) Engrailed-Gal4-gesteuerte Expression von UAS-dNitFhit, UAS-dNit, UAS-dFhit oder kombinierte UAS-dNit+UAS-dFhit unterdrücken die sinnlose Expression in Drosophila-Flügel-Imaginalscheiben.Die repressive Wirkung manifestiert sich als reduzierte Intensität und Breite/Dicke des immungefärbten Senseless-Musters.Die Koexpression von UAS-GFP wurde verwendet, um den hinteren Teil der Flügelscheiben zu markieren, wo der Engrailed-Gal4-Treiber aktiv ist.Eine transgene Fliegenlinie, die einen leeren Vektor exprimiert, wurde als Wildtyp-Kontrolle verwendet.Die Analyse der Senseless-Expression bei 29 °C verstärkt die Wirkung, wie in den unteren Feldern gezeigt.Die funktionelle Relevanz der Interaktion zwischen dNitFhit und Armadillo wurde detaillierter unter Verwendung des Wg/Armadillo-Transkriptionsreporters Wingful-Luciferase in Drosophila Kc- oder S2R+-Zellen getestet.Sowohl dNitFhit in voller Länge als auch seine Unterteile dFhit und dNit allein unterdrückten die Reportergenaktivität dosisabhängig signifikant.Interessanterweise hatten die getrennten dNit- und dFhit-Domänen allein eine schwächere repressive Wirkung, aber die Koexpression von beiden zeigte eine additive Wirkung (ergänzende Abbildung S8D).Als nächsten Schritt untersuchten wir diese repressive Rolle in vivo.Unter Verwendung des attP/ΦC31-Integrationssystems erzeugten wir transgene Drosophila-Linien, die dNitFhit (und dNit oder dFhit) unter der Kontrolle des heterologen UAS-Promotors exprimieren.Um die repressive Aktivität von UAS-dNitFhit zu beurteilen, konzentrierten wir uns sinnlos auf die Expression des hochschwelligen Wg/Gürteltier-Zielgens.Im Wildtypflügel wird die Imaginalscheibe des dritten Larvenstadiums sinnlos in zwei gut definierten Streifen entlang der dorsoventralen Grenze in unmittelbarer Nähe zu den Wg-sekretierenden Zellen exprimiert [26].Die Überexpression von UAS-dNitFhit, angetrieben durch den Engrailed-Gal4-Treiber im hinteren Teil der Flügelscheiben, reduzierte den Senseless-Ausdruck dramatisch.Die Senseless-Spiegel sind in dem Teil, in dem dNitFhit überexprimiert wird, im Vergleich zu dem vorderen Teil, der als Wildtyp verbleibt, verringert.Dieser repressive Effekt war auch offensichtlich, wenn die getrennten Domänen dNit und dFhit allein überexprimiert wurden, erschien jedoch ausgeprägter, wenn Nit und Fhit zusammen überexprimiert wurden, entweder als dNitFhit-Fusionsprotein oder co-exprimiert ( 6b , oberes Feld).Da das heterologe Gal4/UAS-System temperaturempfindlich ist, haben wir die Effekte auch bei höheren Temperaturen getestet.Wenn NitFhit oder Nit und Fhit über Engrailed-Gal4 bei 29 °C exprimiert wurden, wurde die Expression von Wg target senseless im hinteren Kompartiment fast vollständig blockiert (Abbildung 6b, unteres Feld).Zusammengenommen bestätigen diese genetischen Experimente eindeutig unsere Hypothese, dass dNitFhit als Repressor der Wg-Signalgebung wirken kann und dass diese Repression ein konservierter Mechanismus ist, um die Wnt/β-Catenin-regulierte Zielgenaktivierung auszugleichen.Bei Dickdarmkrebs wird der kanonische Wnt-Signalweg abweichend mit hoher Frequenz aktiviert [27].Somit kann die deregulierte Expression von hNit1 die Tumorentstehung weiter verstärken.Daher untersuchten wir, ob die Nit1-Expression bei menschlichem Krebs verändert ist.Immunhistochemische Analysen von 219 kolorektalen Karzinomproben auf Gewebe-Microarrays zeigten eine hNit1-Färbung überwiegend im Zytoplasma und in geringer Menge auch im Zellkern (Abbildung 7).χ2-Test unter Verwendung des Softwarepakets SPSS 13.0 (SPSS, Chicago, IL, USA) ergab, dass die hNit1-Färbung in gut differenzierten Tumoren signifikant intensiver war als in schlecht differenzierten Tumoren (P = 0,036), was mit seiner Tumorsuppressorfunktion übereinstimmt.Obwohl eine große Anzahl von pN1+-Tumoren eine reduzierte Färbung von hNit1 aufwies, war die Korrelation mit der Beteiligung von Lymphknoten oder dem Überleben der Patienten statistisch nicht signifikant (p = 0,06 bzw. p = 0,298).Die HNit1-Expression ist bei dedifferenziertem menschlichen Dickdarmkrebs reduziert.Gewebe-Microarrays mit 219 humanen kolorektalen Karzinomproben wurden mit dem monoklonalen Anti-Nitrilase1 (1C3)-Antikörper auf hNit1 gefärbt.(a) Häufigkeiten negativer (0), schwach positiver (1), mäßig positiver (2) und stark positiver (3) Färbungen in Tumorproben nach Tumorstadium.(b) Immunhistochemische Färbung von hNit1 in einem gut (links) und einem schlecht differenzierten (rechts) kolorektalen Karzinom (100-fache Vergrößerung).Wir haben zuvor das fragile Histidin-Triadenprotein hFhit als neuen β-Catenin-Interaktionspartner und Repressor der β-Catenin-Transkriptionsaktivität charakterisiert [16, 17], was einen neuen molekularen Mechanismus für die hFhit-Tumorsuppressorfunktion bereitstellt.Bei Lungenkrebs besteht eine starke Korrelation zwischen dem Verlust der hFhit-Expression und dem Gesamtüberleben, sowohl bei Adenokarzinom- als auch Plattenepithelkarzinomen.Darüber hinaus war die zytoplasmatische Akkumulation von β-Catenin beim Adenokarzinom und die MUC1-Expression beim Plattenepithelkarzinom mit einem kürzeren Überleben verbunden [28].Im Zusammenhang mit unseren Studien impliziert dies, dass der Verlust der Fhit-Expression zu einer verstärkten β-Catenin-Signalübertragung und einer schlechteren Prognose bei Lungenkrebs beiträgt.Interessanterweise wird Fhit in Drosphila als Fusionsprotein mit Nit1 exprimiert, wodurch dNitFhit als Rosetta-Stone-Protein definiert wird [5].Die Rosetta-Stone-Hypothese sagt voraus, dass Proteine, die in einem Organismus als Fusionsprotein exprimiert werden, in den Organismen, in denen sie als einzelne Proteine ​​exprimiert werden, funktionell verbunden sind.Vor diesem Hintergrund stellten wir die Hypothese auf, dass hNit1 auch die Wnt/β-Catenin-Signalgebung modulieren könnte.Hier zeigen wir, dass hNit1 tatsächlich mit β-Catenin interagiert und die β-Catenin-Zielgenexpression in Reportergen-Assays und quantitativer Reverse-Transkriptase-PCR-Analyse von endogenen Zielgenen negativ reguliert.In Übereinstimmung mit der beobachteten repressiven Aktivität hemmt hNit1 auch die Wnt-induzierte Doppelachsenbildung in Xenopus-Embryonen.Darüber hinaus verstärkte die Kotransfektion von hFhit die repressive Wirkung von hNit1 in Reportergen-Assays, was darauf hindeutet, dass beide Proteine ​​in der Lage sind, in Signalwegen wie dem kanonischen Wnt-Weg zusammenzuarbeiten.Dementsprechend zeigt ein künstliches hNit1-hFhit-Fusionsprotein eine ähnliche repressive Aktivität wie kotransfiziertes hNit1 und hFhit.Ein solcher kombinierter und additiver repressiver Effekt wurde auch bei Nit1−/−Fhit−/− Doppel-Knockout-Mäusen beobachtet [10].Außerdem bindet das Drosophila-dNitFhit-Rosetta-Stone-Protein, bei dem Fhit C-terminal an den Nit-Teil fusioniert ist, in ähnlicher Weise an das β-Catenin-Homologe Armadillo und wirkt als Repressor des Wg/Armadillo-Signalwegs.Interessanterweise sind beide Unterteile – dNit und dFhit – in der Lage, die Wg-Signalgebung unabhängig voneinander zu unterdrücken und zeigten einen additiven Effekt bei der Entwicklung der Imaginalscheibe von Drosophila, was wiederum eine gemeinsame Funktion unterstützt, wie von der Rosetta-Stone-Hypothese vorgeschlagen.Darüber hinaus zeigt die Analyse des Drosophila-Fusionsproteins dNitFhit, dass die Wnt/Wg-reprimierende Aktivität von Nit und Fhit evolutionär konserviert ist.Bei der direkten Bindung an die Arm-Repeat-Region von β-Catenin verwendet hNit1 eine andere Stelle als hFhit [17].Daher ist es möglich, dass ein ternärer Komplex aus hNit1, β-Catenin und hFhit gebildet wird.Im Gegensatz zu hFhit kann hNit1 neben β-Catenin auch direkt an LEF-1/TCF-Transkriptionsfaktoren binden.Interessanterweise legen unsere Daten nahe, dass hNit1 an eine Stelle bindet, die nicht der β-Catenin-Bindungsstelle entspricht.Die Deletion der N-terminalen β-Catenin-Bindungsstelle beeinträchtigte die Bindung von hNit1 an TCF-4 nicht.Die Co-Repressoren TLE (Transducin-like Enhancer of Split)/Groucho binden ebenfalls an zwei Stellen, die sich von der β-Catenin-Bindungsstelle unterscheiden [29], und werden als Reaktion auf die Wnt-Stimulation von LEF-1/TCF dissoziiert.TLE wirkt als Tetramer auf LEF/TCFs nicht durch direkte Konkurrenz, sondern durch unterschiedliche Affinitäten, die einen Aktivierungs-Repressions-Schalter vermitteln [30].Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenDieses Werk ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert.Die Bilder oder andere Materialien von Drittanbietern in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe nicht anders angegeben;Wenn das Material nicht unter die Creative Commons-Lizenz fällt, müssen Benutzer die Erlaubnis des Lizenzinhabers einholen, um das Material zu reproduzieren.Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:Leider ist für diesen Artikel derzeit kein teilbarer Link verfügbar.Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt